腹瀉型腸易激綜合征大鼠模型中差異表達(dá)microRNA的篩選及miRNA-490-5p對(duì)類(lèi)胰蛋白酶的影響.pdf

1、目的:通過(guò)生物信息學(xué)分析，在腹瀉型腸易激綜合征大鼠模型中篩選出感興趣的miRNAs分子。針對(duì)感興趣的miRNA，通過(guò)構(gòu)建miRNA-490-5p慢病毒載體，研究miRNA-490-5p對(duì)類(lèi)胰蛋白酶的影響，并探討其可能的機(jī)制，以深入闡明microRNA在腹瀉型腸易激綜合征的發(fā)生發(fā)展中的重要性，也為腹瀉型腸易激綜合征的診斷和治療提供新的思路。研究共分為二部分:一、腹瀉型腸易激綜合征大鼠模型中差異表達(dá)microRNA的篩選及驗(yàn)證;二、腹瀉型腸

2、易激綜合征大鼠模型中miRNA-490-5p對(duì)類(lèi)胰蛋白酶的影響。
　　方法：
　　一、腹瀉型腸易激綜合征大鼠模型中差異表達(dá)microRNA的篩選及驗(yàn)證在miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)本課題組前期人結(jié)腸組織IBS-D/N組miRNA芯片篩選出的差異表達(dá)顯著的72個(gè)miRNAs進(jìn)行目標(biāo)microRNA的篩選;用乙酸灌腸加束縛應(yīng)激的方法構(gòu)建IBS-D大鼠模型，分別為正常對(duì)照組（正常組）8只、造模組（IBS-D組）16只，兩組均采用結(jié)腸敏感性

3、檢測(cè)及腹壁撤離反射(AWR)評(píng)分對(duì)其內(nèi)臟敏感性進(jìn)行評(píng)估并檢測(cè)兩組大鼠的糞便性狀及胃腸通過(guò)時(shí)間，同時(shí)行H&E染色評(píng)價(jià)結(jié)腸粘膜組織學(xué)改變;取結(jié)腸組織對(duì)目標(biāo)microRNAs通過(guò)qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證。
　　二、腹瀉型腸易激綜合征大鼠模型中miRNA-490-5p對(duì)類(lèi)胰蛋白酶的影響
　　健康wistar大鼠29只，隨機(jī)分為4組，分別為正常對(duì)照組（正常組）5只、IBS-D組（造模組）8只、慢病毒空載體對(duì)照組（空載組）8只、慢病毒mi

4、RNA-490-5p沉默組（沉默組）8只，采用乙酸灌腸加束縛應(yīng)激的方法制造IBS-D大鼠模型;模型評(píng)估方法同方法一;構(gòu)建慢病毒miRNA-490-5p沉默載體和慢病毒空載體，通過(guò)大鼠尾靜脈注射慢病毒及空載體，10天后處死大鼠，取結(jié)腸粘膜組織用H&E染色評(píng)價(jià)結(jié)腸粘膜組織學(xué)改變，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)慢病毒干預(yù)后miRNA-490-5p的表達(dá)量，通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)類(lèi)胰蛋白酶的表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　一、腹瀉型腸易激綜合征大

5、鼠模型中差異表達(dá)microRNA的篩選及驗(yàn)證
　　1.在miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)共篩選出4個(gè)目標(biāo)microRNA: miR-143-5p、miR-490-5p、miR-204-5p、miR-29b-1-5p。
　　2.IBS-D大鼠的糞便Bristol性狀評(píng)級(jí)為5-7級(jí)，與正常組對(duì)比，造模組大便濕重及大便含水量明顯增高，大鼠腹部收縮反射的最小閾值較正常組低，腸道傳輸時(shí)間較正常組短，上述指標(biāo)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。在0.8

6、ml、1.2mi、1.6ml結(jié)腸容量擴(kuò)張時(shí)，造模組大鼠腹部收縮次數(shù)明顯高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　3.H&E染色結(jié)果顯示:正常組和造模組大鼠的結(jié)腸組織炎癥Kruschewski評(píng)分為0-1分，未見(jiàn)明顯炎癥。
　　4.qRT-PCR結(jié)果:與正常組相比，造模組結(jié)腸組織中rno-miR-143-5p、rno-miR-490-5p的表達(dá)下降，而rno-miR-143-5p、rno-miR-490-5p的表達(dá)

7、量上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　二、腹瀉型腸易激綜合征大鼠模型中miRNA-490-5p對(duì)類(lèi)胰蛋白酶的影響
　　1.大鼠IBS-D模型建模評(píng)估指標(biāo)結(jié)果顯示:正常組大鼠糞便Bristol性狀評(píng)級(jí)為3-4級(jí)，造模組、空載組、沉默組大鼠糞便Bristol性狀評(píng)級(jí)為5-7級(jí);與正常組相比，其余各組大鼠的糞便含水量明顯增多，糞便腸道通過(guò)時(shí)間明顯縮短，結(jié)腸擴(kuò)張腹壁反射最小注水閾值減小(P＜0.05)。
　　2.

8、qRT-PCR結(jié)果顯示:沉默組的miR-490-5p比造模組、正常組及空載組的表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.H&E染色:四組大鼠結(jié)腸組織炎癥Kruschewski評(píng)分為0-1分，均無(wú)明顯炎癥反應(yīng)，大鼠造模成功結(jié)腸黏膜組織結(jié)構(gòu)正常。
　　4.免疫組化法結(jié)果顯示:沉默組分別與空載組、造模組、正常組比較，其類(lèi)胰蛋白酶的表達(dá)量均下降，且差異均有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);正常組分別與空載組、造模組

9、比較時(shí)，其類(lèi)胰蛋白酶的表達(dá)量下降，且差異均有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.IBS-D大鼠模型構(gòu)建成功。
　　2.大鼠體內(nèi)存在4個(gè)microRNAs(miR-143-5p、miR-490-5p、miR-204-5p、miR-29b-l-5p)，且在腹瀉型腸易激綜合征中miR-143-5p、miR-490-5p的表達(dá)量上調(diào)，miR-204-5p、miR-29b-1-5p表達(dá)下調(diào)，提示mircoRN