EIAV疫苗株gp90基因的多克隆構(gòu)成和體內(nèi)進(jìn)化與免疫保護(hù)的相關(guān)性.pdf

1、中國馬傳貧(EIA)弱毒疫苗，是可良好誘導(dǎo)針對(duì)慢病毒的免疫保護(hù)并唯一被成功大規(guī)模應(yīng)用的慢病毒疫苗。明確EIA弱毒疫苗致弱和誘導(dǎo)免疫保護(hù)的機(jī)制，將對(duì)慢病毒免疫機(jī)制研究和制定疫苗研制策略提供有益的參考。本文選擇中國EIA驢胎皮細(xì)胞適應(yīng)性弱毒疫苗EIAVFDDV為研究對(duì)象，對(duì)該弱毒疫苗的病毒種群構(gòu)成和體內(nèi)復(fù)制特點(diǎn)及二者與誘導(dǎo)免疫保護(hù)的相關(guān)性進(jìn)行了探討。 使用RT-PCR和克隆測序技術(shù)，對(duì)EIAVFDDVgp90基因的多樣性進(jìn)行了分析

2、。隨機(jī)獲得的52個(gè)gp90基因的不同克隆，同源率在96％-100％不等，推導(dǎo)的氨基酸序列差異最高可達(dá)6.5％。該差異結(jié)合進(jìn)化樹和推導(dǎo)的氨基酸序列的聚類分析結(jié)果，提示經(jīng)過無宿主特異性免疫壓力的長期體外傳代培養(yǎng)得到的EIAVFDDV，其病毒種群存在著豐富的基因多樣性、呈混合構(gòu)成狀態(tài)。我們將該構(gòu)成特性，稱作“多克隆構(gòu)成”。 通過分析免疫成熟過程中不同時(shí)間點(diǎn)EIAVFDDV免疫馬匹外周血中EIAVgp90基因的序列，可對(duì)多克隆構(gòu)成的E

3、IAVFDDV在免疫馬匹體內(nèi)的進(jìn)化動(dòng)態(tài)做如下描述：免疫后15天，EIAVFDDV的部分毒株可以克服宿主的天然免疫壓力對(duì)宿主進(jìn)行感染。2-4個(gè)月時(shí)，疫苗弱毒株在宿主體內(nèi)以趨于單一的、且可能相對(duì)于親本強(qiáng)毒珠出現(xiàn)回復(fù)突變的準(zhǔn)種形式存在。免疫后4-6個(gè)月時(shí)，趨于單一的、且基因構(gòu)成EIAVFDDV較為相近的病毒種群，將替代2-4個(gè)月時(shí)發(fā)生突變的病毒種群作為免疫成熟時(shí)的準(zhǔn)種，相對(duì)穩(wěn)定地存在于宿主血漿中。同時(shí)，血漿病毒載量監(jiān)測結(jié)果表明，免疫成熟過程中

4、，外周血游離病毒粒子的RNA拷貝數(shù)在102-105拷貝/ml范圍內(nèi)的低拷貝水平波動(dòng)。 使用連續(xù)給予地塞米松的方法，對(duì)EIAVFDDV免疫成熟馬匹進(jìn)行了免疫功能抑制，并對(duì)比監(jiān)測了免疫抑制前后馬匹血漿中疫苗毒株的載量。監(jiān)測結(jié)果表明，3匹免疫馬在免疫功能受抑制后，2匹血漿中EIAV載量中略有下降，而1匹略有上升，但載量水平均處于免疫馬匹體內(nèi)EIAVFDDV載量變化的正常范圍。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，疫苗毒株的生物學(xué)特性，而非免疫壓力是EIA

5、VFDDV在宿主血漿中低拷貝存在的主要原因。而在免疫系統(tǒng)功能受抑制狀態(tài)下，疫苗株在馬體內(nèi)仍維持穩(wěn)定的低拷貝復(fù)制狀態(tài)，支持了疫苗株EIAVFDDV，應(yīng)用中的安全性。 使用EIAVFDDV與基于EIAVFDDV單一毒株基因背景構(gòu)建和拯救出的疫苗感染性克隆毒EIAVFDDV3-8，分別免疫馬匹，并在免疫成熟后進(jìn)行攻毒。攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多克隆構(gòu)成的EIAVFDDV誘導(dǎo)的免疫保護(hù)明顯優(yōu)于構(gòu)成相對(duì)單一的感染性克隆毒EIAVFDDV3-8