脊尾白蝦免疫相關(guān)基因的克隆和表達(dá)分析.pdf

1、脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)具有繁殖能力強(qiáng)、生長(zhǎng)季節(jié)長(zhǎng)、環(huán)境適應(yīng)性廣的特點(diǎn)，是我國(guó)重要的底棲蝦類(lèi)。近年來(lái)隨著我國(guó)沿海灘涂地區(qū)的開(kāi)發(fā)，脊尾白蝦已經(jīng)成為我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種，其人工養(yǎng)殖的規(guī)模發(fā)展迅速，養(yǎng)殖面積已超過(guò)20萬(wàn)畝，養(yǎng)殖產(chǎn)量已占我國(guó)東部沿海混養(yǎng)池塘總產(chǎn)量的1/3，成為黃渤海沿海灘涂地區(qū)主要的特色水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。但隨著養(yǎng)殖面積的擴(kuò)大，病害問(wèn)題也日益嚴(yán)重起來(lái)，給養(yǎng)殖戶(hù)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)脊尾白蝦免疫相關(guān)

2、基因的研究，有助于深入研究脊尾白蝦病原防御機(jī)制，理解其作用機(jī)理，從而有助于提高脊尾白蝦抗病能力，更好的完成病害防治的過(guò)程為脊尾白蝦抗病品種選育及大規(guī)模養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。
　　本研究在本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的脊尾白蝦血細(xì)胞cDNA文庫(kù)獲得了脊尾白蝦α2-巨球蛋白基因EST序列，采用cDNA末端快速擴(kuò)增（rapid amplification of cDNA end, RACE）技術(shù)克隆獲得脊尾白蝦α2-巨球蛋白基因cDNA全長(zhǎng)，命名為Ecα2

3、M基因。該基因全長(zhǎng)4823bp，由4413bp的開(kāi)放閱讀框，64bp的5'端非編碼區(qū)，以及346bp的3'端非編碼區(qū)組成，開(kāi)放閱讀框編碼1470個(gè)氨基酸，分子量為163.0 kDa，理論等電點(diǎn)為5.03。序列分析表明，Ecα2M序列N端含有23個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。同源性分析表明，脊尾白蝦 Ecα2M基因氨基酸序列與羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)α2M的同源性最高，達(dá)到80％。熒光定量PCR分析結(jié)果表明，

4、Ecα2M基因在血細(xì)胞、肝胰腺、肌肉、鰓、卵巢、眼柄、胃及腸中均有表達(dá)，其中在血細(xì)胞當(dāng)中的相對(duì)表達(dá)量最高。感染鰻弧菌和WSSV后3h和6h，脊尾白蝦血細(xì)胞和肝胰腺中 Ecα2M的表達(dá)量較對(duì)照組均極顯著增加(P<0.05)，且具有明顯的時(shí)間差異性。本研究結(jié)果表明Ecα2M基因在脊尾白蝦免疫反應(yīng)中具有重要作用。
　　采用RACE技術(shù)克隆獲得脊尾白蝦14-3-3基因cDNA全長(zhǎng)，命名為Ec14-3-3。該基因全長(zhǎng)2905bp，包含744

5、bp的開(kāi)放閱讀框，127bp的5'端非編碼區(qū)(UTR)以及2033bp的3'端非編碼區(qū)。，開(kāi)放閱讀框編碼247個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量為27.95 kDa，理論等電點(diǎn)為4.65。同源性分析表明，脊尾白蝦Ec14-3-3基因氨基酸序列與斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)14-3-3的同源性最高，達(dá)到98％。熒光定量PCR分析結(jié)果表明，Ecα2M基因在血細(xì)胞、肝胰腺、肌肉、鰓、卵巢、眼柄、胃及腸中均有表達(dá)，其中在血細(xì)胞當(dāng)中的相對(duì)

6、表達(dá)量最高。感染鰻弧菌和WSSV后6h，脊尾白蝦血細(xì)胞和肝胰腺中Ec14-3-3的表達(dá)量較對(duì)照組均極顯著增加(P<0.05)，且具有明顯的時(shí)間差異性。本研究結(jié)果表明 Ec14-3-3基因在脊尾白蝦免疫反應(yīng)中具有重要作用。
　　采用 RACE技術(shù)克隆獲得脊尾白蝦 C-型凝集素基因 cDNA全長(zhǎng)，命名為EcCTL。該基因全長(zhǎng)全長(zhǎng)1285bp，包含1041bp的開(kāi)放閱讀框，62bp的5'端非編碼區(qū)(UTR)以及182bp的3'端非編碼區(qū)

7、。，開(kāi)放閱讀框編碼346個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量為38.56kDa，理論等電點(diǎn)為4.29。同源性分析表明，脊尾白蝦EcCTL基因氨基酸序列與秀麗白蝦(Palaemon modestus)的同源性最高，達(dá)到91％。熒光定量PCR分析結(jié)果表明，EcCTL基因在血細(xì)胞、肝胰腺、肌肉、鰓、卵巢、眼柄、胃及腸中均有表達(dá)，其中在肝胰腺當(dāng)中的相對(duì)表達(dá)量最高。感染鰻弧菌和WSSV后6-12h，脊尾白蝦血細(xì)胞和肝胰腺中 EcCTL的表達(dá)量較對(duì)照組均極