檢測(cè)五種腹瀉相關(guān)病毒多重Rt-PCR方法的建立和2013年9月～2014年10月廣州地區(qū)腹瀉病原譜調(diào)查.pdf

1、本研究包括以下三個(gè)部分:
　　一、2013年9月～2014年10月廣州地區(qū)腹瀉病原譜調(diào)查
　　腹瀉病因復(fù)雜，其中與感染性腹瀉相關(guān)病原體種類繁多，包括細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)三大類。每類病原體包含了眾多的常見(jiàn)致病菌/病毒，例如沙門(mén)氏菌、彎曲菌、輪狀病毒和諾如病毒。對(duì)于腹瀉病因的診斷，依賴于臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)腹瀉糞便標(biāo)本的檢測(cè)。目前臨床常規(guī)檢測(cè)方法有細(xì)菌培養(yǎng)、病毒免疫膠體金法檢測(cè)和寄生蟲(chóng)鏡檢，較少使用分子生物學(xué)方法。檢測(cè)存在耗時(shí)長(zhǎng)，靈敏度和

2、特異性不理想等缺點(diǎn)。而目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于腹瀉病因的調(diào)查，由于檢測(cè)方法的局限，多集中于病毒或細(xì)菌某一類病原體的檢測(cè)報(bào)道。另外，據(jù)《廣州經(jīng)濟(jì)社會(huì)白皮書(shū)》報(bào)道，廣州于2013年底成為中國(guó)繼重慶、上海、北京和天津之后第五個(gè)千萬(wàn)人口規(guī)模的城市。對(duì)于一個(gè)常住人口數(shù)巨大的城市而言，腹瀉暴發(fā)流行將會(huì)給社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來(lái)重大的負(fù)擔(dān)。同時(shí)，廣州地區(qū)對(duì)于腹瀉病因的研究尚不夠充分。因此，采用先進(jìn)的方法對(duì)本地區(qū)腹瀉病因進(jìn)行監(jiān)控是十分有必要的。
　　我們收集了廣州

3、市海珠區(qū)珠江醫(yī)院從2013年9月至2014年10月，共289份門(mén)診/住院腹瀉患者的糞便標(biāo)本，采用基于液相懸浮芯片技術(shù)的xTAGGastrointestinal Pathogen Panel(xTAG GPP)試劑盒檢測(cè)腹瀉糞便標(biāo)本。該試劑盒覆蓋檢測(cè)15種病原體，包括9種細(xì)菌（彎曲菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、艱難梭菌毒素A/B、霍亂弧菌、O157型大腸桿菌、產(chǎn)志賀樣毒素大腸桿菌、腸毒素型大腸桿菌）、3種病毒（A組輪狀病毒、

4、諾如病毒GⅠ型和GⅡ型、腺病毒40/41型）和3種寄生蟲(chóng)（隱孢子蟲(chóng)、藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)、溶組織阿米巴）。并且，能在5小時(shí)內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了腹瀉病因的快速準(zhǔn)確診斷。通過(guò)xTAG GPP的檢測(cè)結(jié)果，分析廣州地區(qū)腹瀉病原譜構(gòu)成、病毒性病原優(yōu)勢(shì)流行株、細(xì)菌性/病毒性病原流行季節(jié)等情況。
　　本研究中，總樣本陽(yáng)性率為74.4％(215/289)。其中，細(xì)菌性腹瀉占47.4％，病毒性腹瀉占35.0％。細(xì)菌性腹瀉以沙門(mén)氏菌、彎曲菌和艱難梭菌感染

5、為主，占89.0％;病毒性腹瀉以輪狀病毒、諾如病毒GⅡ型感染為主，占92.1％。各種病原體檢測(cè)結(jié)果與臨床流行病學(xué)因素的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，細(xì)菌性腹瀉全年均可發(fā)生，呈炎熱季節(jié)高發(fā)的特點(diǎn)，易感年齡段分布不明確;而病毒性腹瀉有明顯寒冷季節(jié)高發(fā)和1～3歲年齡段易感的特點(diǎn)。在臨床癥狀的差異上，細(xì)菌性腹瀉更容易出現(xiàn)糞便白細(xì)胞/紅細(xì)胞/隱血試驗(yàn)陽(yáng)性，而病毒性腹瀉更容易發(fā)生嘔吐等并發(fā)癥。另外，對(duì)于病毒檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本，進(jìn)行基因分型研究。G2P[8]型輪狀病毒

6、、GⅡ.4型諾如病毒為優(yōu)勢(shì)流行株。本研究中腹瀉病原體呈現(xiàn)的流行病學(xué)特征與目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果相符。
　　二、檢測(cè)五種腹瀉相關(guān)病毒多重RT-PCR方法的建立
　　腹瀉病因的診斷對(duì)于臨床治療的開(kāi)展與正確用藥至關(guān)重要。區(qū)分細(xì)菌性腹瀉和病毒性腹瀉，能有效提高臨床治療效果、避免濫用抗生素和給患者帶來(lái)不必要的經(jīng)濟(jì)損失。臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)于細(xì)菌性腹瀉的檢測(cè)，常規(guī)方法為腹瀉糞便培養(yǎng)。細(xì)菌培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)（約3～5天時(shí)間），且對(duì)操作人員的實(shí)驗(yàn)技

7、術(shù)要求較高。臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)于病毒性腹瀉的檢測(cè)，常規(guī)方法為免疫膠體金法。免疫法快速簡(jiǎn)便，但是特異性和靈敏度尚不理想，且覆蓋病毒性病原譜有限，容易造成漏診?；谝合鄳腋⌒酒夹g(shù)的xTAG GPP，具有靈敏、特異、高通量的多重檢測(cè)功能。但由于其價(jià)格昂貴，臨床實(shí)驗(yàn)室無(wú)法常規(guī)開(kāi)展。因此，我們想建立一種檢測(cè)病毒性腹瀉常見(jiàn)病原的多重RT-PCR方法，實(shí)現(xiàn)臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)病毒性腹瀉的快速準(zhǔn)確診斷，或者結(jié)合免疫膠體金法檢測(cè)結(jié)果以最大可能排除病毒性腹瀉。

8、　　建立的多重RT-PCR檢測(cè)可涵蓋的病原體包括——諾如病毒GⅠ型和GⅡ型、腺病毒、星狀病毒和札如病毒。選擇文獻(xiàn)報(bào)道的引物，進(jìn)行引物最佳退火溫度的優(yōu)化。通過(guò)對(duì)RT-PCR反應(yīng)體系中各物質(zhì)相對(duì)比例的調(diào)整，選擇最佳的體系配置建立多重RT-PCR。利用輪狀病毒、腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16型、沙門(mén)菌、志賀菌、彎曲菌、艱難梭菌、O157型大腸桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、霍亂弧菌和嗜水氣單胞菌的菌（毒）株等非靶病毒核酸，進(jìn)行特異性驗(yàn)證。構(gòu)建五種

9、病毒質(zhì)粒，倍比稀釋后進(jìn)行RT-PCR和多重RT-PCR對(duì)于靶病毒的檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)和靈敏度比較。利用多重RT-PCR和多重檢測(cè)液相懸浮芯片試劑盒xTAGGPP、RT-PCR平行檢測(cè)107份標(biāo)本。因xTAG GPP不包含多重RT-PCR可檢測(cè)的星狀病毒和札如病毒，其檢測(cè)以RT-PCR為參考，以后兩者為參考方法評(píng)估多重RT-PCR對(duì)五種腹瀉相關(guān)病毒的檢測(cè)靈敏度、特異性以及與兩種方法的吻合度。
　　研究結(jié)果表明，建立的多重RT-PCR方法與液

10、相懸浮芯片、RT-PCR的檢測(cè)吻合度高，κ值分別為0.885和1.0。以液相懸浮芯片為標(biāo)準(zhǔn)，多重RT-PCR檢測(cè)靈敏度為80.8％，特異度為100％。多重RT-PCR對(duì)五種病毒的檢測(cè)限為104copies/μL～106copies/μL。
　　三、廣州地區(qū)2013-2014年星狀病毒和札如病毒感染性腹瀉基因型分析
　　病毒性腹瀉的常見(jiàn)病原包括輪狀病毒、諾如病毒GⅠ型和GⅡ型、腺病毒40/41型、星狀病毒和札如病毒。目前，國(guó)內(nèi)

11、外對(duì)于輪狀病毒、腺病毒和諾如病毒感染均有詳盡的流行病學(xué)調(diào)查資料。由于星狀病毒和札如病毒檢出率較低，兩者的流行病學(xué)報(bào)道尚不夠詳細(xì)。人星狀病毒(Human astrovirus，HAstV)屬于星狀病毒科哺乳動(dòng)物星狀病毒屬。病毒基因?yàn)閱喂烧淩NA，基因組全長(zhǎng)約7.0kb，全基因組有3個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)。根據(jù)衣殼蛋白的編碼基因可以將星狀病毒分為8個(gè)經(jīng)典基因型(HAstV—1～8)。札如病毒(Sapovirus，SaV)與諾如病毒同屬于杯

12、狀病毒科，其為單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約7.5kb，含有2個(gè)ORF。根據(jù)VP1序列，札如病毒至少可以分為5個(gè)基因型(GⅠ～GⅤ)。GⅠ型、GⅡ型、GⅣ型和GⅤ型主要感染人，而GⅢ型主要感染動(dòng)物。本研究的目的是了解廣州地區(qū)腹瀉患者中星狀病毒和札如病毒感染的流行情況，分析其基因型特征。
　　利用實(shí)驗(yàn)室建立的多重RT-PCR方法檢測(cè)星狀病毒、札如病毒、諾如病毒GⅠ型/GⅡ型和腺病毒。對(duì)于星狀病毒和札如病毒檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行測(cè)序比對(duì)

13、，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，分析優(yōu)勢(shì)流行亞型。收集2013年10月-2014年9月廣州市海珠區(qū)珠江醫(yī)院門(mén)診和住院病人腹瀉糞便樣本，提取糞便標(biāo)本核酸，進(jìn)行多重RT-PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，273份糞便樣本中，星狀病毒陽(yáng)性率為3.3％(9/273)，檢出基因型為星狀病毒1型、2型、4型和8型。札如病毒陽(yáng)性率為1.5％(4/273)，基因型均為札如病毒GⅠ型。
　　綜上，對(duì)2013年9月～2014年10月廣州地區(qū)腹瀉病例信息和標(biāo)本的收集，并利用液相