MiR-145在原發(fā)性膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中的表達及其意義.pdf

1、研究目的：
　　探討miR－145在原發(fā)性膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中的表達及其對正常軟骨細胞的生物學(xué)作用，從而為探討其在骨性關(guān)節(jié)炎中的作用機制奠定基礎(chǔ)。
　　研究方法：
　　收集原發(fā)性膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎20例和正常膝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)軟骨10例，對軟骨進行細胞培養(yǎng)，并根據(jù)改良的Mankin評分標準對骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨進行分組。應(yīng)用免疫組化的方法檢測miR－145在各組軟骨組織中的表達；使用RT-PCR方法檢測各組軟骨組織中miR－1

2、45的表達，應(yīng)用RT-PCR方法檢測軟骨細胞中MMP13、X型膠原、RNAK、堿性磷酸酶mRNA的表達，western blot檢測軟骨細胞中MMP13、X型膠原、RANK、堿性磷酸酶的蛋白表達；所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　通過生物信息分析技術(shù)分析軟骨細胞中miR-145的靶向調(diào)控基因表達差異，尋找軟骨與miR－145共表達基因，并驗證。通過Lipofectamine?2000試劑將其轉(zhuǎn)染軟骨細胞，通過

3、RT-PCR檢測軟骨細胞中相關(guān)基因的表達量，westernblot檢測軟骨細胞中相關(guān)蛋白的表達量。通過干擾TNFRSF11B，探索其對miR－145抑制的軟骨細胞膠原蛋白表達的影響。
　　研究結(jié)果：
　　MiR－145在正常膝關(guān)節(jié)和原發(fā)性膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨中均有表達,其主要位于軟骨細胞的胞漿中，RT-PCR結(jié)果顯示miR－145的表達在骨性關(guān)節(jié)炎軟骨組織中明顯低于正常膝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)軟骨(P<0.05)，western

4、blot的結(jié)果同樣提示原發(fā)性骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中miR－145蛋白含量均顯著低于正常膝關(guān)節(jié)軟骨(P<0.05)，而且隨著骨性關(guān)節(jié)炎嚴重程度的提高，miR－145的表達、蛋白含量逐步降低，在重度骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中這些差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　為了進一步探討miR－145對正常軟骨細胞生物學(xué)的影響，我們成功將其轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的軟骨細胞，RT-PCR和western blot對軟骨細胞進行檢測分析，結(jié)果顯示：MMP13、Co

5、llagen X膠原纖維蛋白受到抑制；大劑量時（100nM），RANK蛋白表達受到抑制，對ALP的作用不明顯；但上述抑制并不依賴于miR－145的濃度。
　　對GSE17785表達普芯片進行分析，骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因為732個，miR－145相關(guān)基因有192個，同時與軟骨相關(guān)和miR－145相關(guān)的基因有13個；在miR－145過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染軟骨細胞后，對關(guān)鍵基因蛋白TNFRSF11B進行檢測，結(jié)果表明，隨著miR－145濃度增加，TN

6、FRSF11B蛋白表達降低。正常關(guān)節(jié)軟骨與不同退變程度的骨關(guān)節(jié)炎（輕度、中度及重度），其軟骨組織中TNFRSF11B表達隨著退變程度加重，表達水平增高。方差分析顯示，TNFRSF11B在正常組織中表達最低，在重度退變軟骨中呈高表達，與其余三組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），而在輕度和重度退變的組織中表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。關(guān)節(jié)軟骨細胞經(jīng)TNF－a誘導(dǎo)處理，檢測其中TNFRSF11B基因表達，驗證軟骨細胞中TNFRSF1

7、1B基因變化，結(jié)果顯示，TNFRSF11B在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中高表達，在正常軟骨細胞中低表達。對軟骨細胞TNFRSF11B進行干擾，并進行miR－145過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，檢測細胞中與軟骨相關(guān)的蛋白的表達，研究結(jié)果表明，MMP13和ALP蛋白變化趨勢不明顯，RANK蛋白變化明顯，collagen X和TNFRSF11B蛋白明顯增加。
　　研究結(jié)論：
　　1、原發(fā)性膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的軟骨中 miR－145的表達較正常軟骨顯著降低，