Ras-GTP酶蛋白R(shí)ASAL2對(duì)卵巢癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用以及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、上皮性卵巢癌（EOC）是最常見的婦科惡性腫瘤之一，也是女性第五大癌癥死亡原因。2015年，在全美預(yù)計(jì)的新發(fā)病人數(shù)與死亡人數(shù)分別為21,290與14,180。其中50％以上的卵巢癌患者年齡超過65周歲。因此卵巢癌是目前威脅女性健康的首要疾病之一。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮細(xì)胞逐漸失去其代表性的細(xì)胞極性與細(xì)胞間連接，而獲得間質(zhì)細(xì)胞所具有的侵襲與遷移能力的過程。目前普遍認(rèn)為

2、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與癌癥轉(zhuǎn)移的起始過程，促進(jìn)癌癥細(xì)胞離開原始位置向遠(yuǎn)端散播。卵巢癌是轉(zhuǎn)移高發(fā)癌癥，EMT對(duì)卵巢癌轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用已有較多報(bào)道，然而卵巢癌EMT的調(diào)控機(jī)制尚不清晰。
　　細(xì)胞外信號(hào)利用多種跨膜信號(hào)傳遞通路調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的生物過程。Ras-GTP酶正是介導(dǎo)這些信號(hào)傳遞通路的關(guān)鍵分子。Ras蛋白（H-Ras，N-Ras，and K-Ras），是 Ras-GTP酶家族最重要的蛋白。其生物學(xué)功能被兩種相反功能的蛋白調(diào)控，鳥嘌呤核酸交換

3、因子（guanine nucleotide exchange factors，GEFs）和GTP酶活化蛋白（GTPase-activating proteins，GAPs）。RASAL2是一種近期新發(fā)現(xiàn)Ras-GAP。有報(bào)道稱其在乳腺癌中具有抑癌作用。但其具體生物學(xué)功能尚不明確。本研究卵巢癌細(xì)胞系為模型，并輔以卵巢癌患者樣本，旨在探索RASAL2在卵巢癌的發(fā)生與轉(zhuǎn)移中的作用與機(jī)制，并期望以此提出新的卵巢癌治療靶點(diǎn)。
　　通過對(duì)57

4、例卵巢癌患者腫瘤樣本cDNA以及8例正常卵巢組織樣本cDNA分析發(fā)現(xiàn)，雖然RASAL2的表達(dá)與卵巢癌患者的年齡和組織學(xué)分型無(wú)關(guān)，但其與卵巢癌的病理分級(jí)以及臨床分期顯著相關(guān)。提示RASAL2在卵巢癌中可能作為一種抑癌因子發(fā)揮作用。我們?cè)谌N卵巢癌細(xì)胞系 SKOV3，OVCAR3和A2780中分別敲低了RASAL2的表達(dá)。利用軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)，侵襲與遷移實(shí)驗(yàn)，裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)等對(duì)RASAL2在卵巢癌生物學(xué)中作用進(jìn)行了初步探索。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示

5、，RASAL2敲低促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞軟瓊脂集落形成以及體內(nèi)成瘤能力。而且細(xì)胞體外侵襲與遷移能力都有顯著提升。這說(shuō)明RASAL2在卵巢癌中具有抑癌作用，特別是具有抑制侵襲遷移能力。
　　EMT常被癌癥利用從而促進(jìn)其自身轉(zhuǎn)移。我們利用qPCR，免疫印記與免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了RASAL2敲低對(duì)卵巢癌細(xì)胞EMT標(biāo)志分子的分布與表達(dá)的影響。并且對(duì)卵巢癌細(xì)胞裸鼠成瘤模型樣本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色或免疫印記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其 EMT標(biāo)志分子表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

6、明，RASAL2敲低可以顯著降低上皮表型蛋白的表達(dá)，與之相反的，間質(zhì)表型標(biāo)志蛋白卻發(fā)生顯著上調(diào)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示E-cadherin在細(xì)胞表面聚集減少，而vimentin卻發(fā)生上調(diào)。體內(nèi)EMT標(biāo)志蛋白檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體外一致。上皮表型蛋白的表達(dá)在RASAL2敲低后下調(diào)，而間質(zhì)表型標(biāo)志蛋白發(fā)生上調(diào)。此外，我們檢測(cè)了卵巢癌患者cDNA中RASAL2與EMT的表達(dá)，并進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，RASAL2的表達(dá)與E-cadherin呈現(xiàn)正相關(guān)

7、。這些結(jié)果說(shuō)明在卵巢癌中RASAL2是EMT的負(fù)向調(diào)控因子。
　　由于RASAL2屬于Ras-GAP蛋白家族。其發(fā)揮調(diào)節(jié)抑癌與抑制EMT作用很可能是通過抑制 Ras-ERK信號(hào)通路完成的。因此我們檢測(cè)了RASAL2敲低對(duì)Ras-ERK通路活化狀態(tài)的影響。結(jié)果顯示在體外RASAL2下調(diào)后，Ras-GTP，p-Raf-1，p-MEK1/2和p-ERK1/2等Ras-ERK核心調(diào)控蛋白都發(fā)生上調(diào)。在體內(nèi)，免疫組化以及免疫印記實(shí)驗(yàn)顯示，R

8、ASAL2敲低卵巢癌組織表現(xiàn)出與體外實(shí)驗(yàn)一致的結(jié)果。這提示 RASAL2可能具有抑制 Ras-ERK通路活性的功能。另外，利用MEK抑制劑PD98059體外抑制ERK活化后，RASAL2敲低所介導(dǎo)的軟瓊脂集落形成，侵襲遷移能力增強(qiáng)以及 EMT都發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。這些是實(shí)驗(yàn)結(jié)果共同表明RASAL2對(duì)卵巢癌的抑癌作用以及EMT的抑制作用可能是依賴于其Ras-ERK活化作用。
　　綜上，我們證實(shí)RASAL2是卵巢癌的抑癌因子，特別是抑制卵巢癌