版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
1、背景:
三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)是體內重要的能量分子及嘌呤神經遞質,可激活P2受體調節(jié)大腦功能,特別是P2X7受體,激活后可引起細胞迅速去極化,引發(fā)胞外Ca2+內流,影響細胞內Ca2+濃度([Ca2+]i)。而反復持續(xù)的刺激P2X7受體可使其形成大的膜孔,允許900D以下有機陽離子及ATP本身自由通過。細菌脂多糖(LPS)處理會引起膠質細胞內白介素-1β前體(pro-IL-1β)急劇增
2、多并逐漸聚集,隨后施加ATP能刺激白介素-1β(IL-1β)的成熟與分泌,促進炎癥的發(fā)生與發(fā)展。
硫化氫(Hydrogen sulfide,H2S)是繼CO、NO后被人們認可的第三氣體信號分子,近年來的研究結果證實H2S對損傷細胞具有保護作用。然而H2S的保護作用是否與ATP-P2X嘌呤信號通路有關則鮮有報道。本實驗在研究ATP-P2X嘌呤信號通路的基礎上探究H2S的影響及作用機制,試圖明確二者間的聯(lián)系并發(fā)現(xiàn)H2S神經保護作用
3、的重要分子機制與靶點。
目的:
制備ATP損傷大鼠小膠質細胞模型,探討硫化氫(H2S)對抗ATP誘導大鼠小膠質細胞損傷中的作用和機制。
方法:
1 NaHS對ATP誘導的大鼠小膠質細胞存活率的影響
1.1含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠小膠質細胞。實驗取對數期分化較好的細胞,吹打均勻,以1×105/L的細胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中,37℃,5%CO2培養(yǎng)24h,隨機分為4組:
4、(1)空白對照組:只含培養(yǎng)基,不含細胞。(2)正常對照組:大鼠小膠質細胞常規(guī)培養(yǎng),不給予ATP處理(即0mmol/L ATP)。(3) ATP組(分別用0.3 mmol/L、1 mmol/L、3mmol/L、5mmol/L、10mmol/L ATP)。不同濃度的ATP誘導大鼠小膠質細胞3h, MTT法檢測細胞存活率。
1.2細胞處理方法同1.1,隨機分為5組,正常對照組、ATP組、NaHS(100、200、400μmol/L)
5、+ATP組。不同濃度的NaHS預孵育30 min后再加入3mmol/L ATP處理3h,并且NaHS始終存在于反應體系中。MTT法檢測每組細胞存活率,0mmol/L ATP組為對照組,其存活率定為100%。
2 NaHS對ATP誘導的大鼠小膠質細胞膜孔形成的影響
2.1對數期分化良好的細胞吹打均勻后,以1×105/L的細胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中,隨機分為:正常對照組,ATP組(0.3 mmol/L、1 mmol/L
6、、3mmol/L、5mmol/L、10mmol/LATP)。ATP與YO-PRO-1(2μmol/L)同時加入體系作用1h后,酶標儀檢測熒光強度。2.2對數期分化良好的細胞吹打均勻后,以1×105/L的細胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中,隨機分為4組,正常對照組、ATP組、NaHS+ ATP組、KN-62(P2X7受體拮抗劑)+ATP組。其中ATP為3mmol/L,NaHS為200μmol/L,KN-62為500nmol/L。NaHS或KN-
7、62預孵育30min后,同時加入ATP和YO-PRO-1作用1小時,酶標儀檢測熒光強度。
3 NaHS對ATP誘導的大鼠小膠質細胞P2X7受體表達的影響
對數期分化良好的細胞吹打均勻接種于60mm培養(yǎng)皿中,隨機分為3組,正常對照組、ATP(3mmol/L)組、NaHS(200μmol/L)+ATP組。Western blotting檢測P2X7受體表達水平。
4 NaHS對ATP-LPS激活的大鼠小膠質細胞
8、IL-1β釋放的影響
對數期分化良好的細胞吹打均勻后接種于60mm培養(yǎng)皿中,隨機分為5組,正常對照組、ATP組、LPS組、ATP+ LPS組、NaHS+ ATP+ LPS組。其中ATP為3mmol/L,LPS為1μg/mL,NaHS為200μmol/L。藥物處理順序依次為首先使用NaHS預孵育30min,加入LPS處理9h后,再給予ATP處理3h(即各組LPS處理時間均為12h),全部藥物處理結束后,收集各組細胞上清液,離心后
9、依照試劑盒說明書操作,檢測各組細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β含量。
結果:
1 NaHS對ATP誘導的大鼠小膠質細胞存活率的影響
1.1不同濃度的ATP對大鼠小膠質細胞存活率的影響以正常對照組細胞存活率為100%,0.3mmol/L ATP組細胞存活率為95.17%,與對照組無明顯差異(P>0.05)。但1 mmol/L、3mmol/L、5mmol/L、10mmol/L ATP組細胞存活率分別為83.03%、7
10、2.13%、68.40%、52.50%,都明顯低于對照組,均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
1.2不同濃度的NaHS對ATP誘導的大鼠小膠質細胞存活率的影響分別給予100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L NaHS預孵育30min后,再加入3mmol/L ATP處理3h。以正常對照組細胞存活率100%,100μmol/LNaHS+ATP、200μmol/LNaHS+ATP、400μmol/LNaHS+ATP組
11、細胞存活率分別為78.41%、91.56%、82.97%,其中200μmol/LNaHS+ATP組細胞存活率明顯高于單純ATP組(P<0.01),表明NaHS對ATP誘導的大鼠小膠質細胞損傷的保護作用具有濃度依賴性,濃度為200μmol/L已達到最佳,400μmol/L的保護作用沒有進一步增加(P>0.05)。
2 NaHS對ATP誘導的大鼠小膠質細胞膜孔形成的影響
2.1不同濃度的ATP誘導的大鼠小膠質細胞膜孔形成
12、酶標儀檢測胞內YO-PRO-1(分子量625D)熒光強度代表膜孔形成。分別給予0mmol/L、0.3mmol/L、1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L、10mmol/L ATP作用大鼠小膠質細胞1h,以正常對照組(0mmol/LATP組)熒光強度為100%,其他各組分別為100.31%、107.86%、112.96%、143.17%、151.82%。其中3mmol/L、5mmol/L及10mmol/L ATP組細胞內熒光強度均
13、顯著高于正常對照組(P<0.05)。表明,ATP可以引起大鼠小膠質細胞膜孔形成,且胞內YO-PRO-1熒光增強取決于ATP濃度,也即具有濃度依賴性。
2.2 NaHS與KN-62對ATP誘導的大鼠小膠質細胞膜孔形成的影響使用NaHS或KN-62預孵育后,再給予ATP處理,兩組細胞內YO-PRO-1熒光強度分別為101.17%、102.23%,均明顯低于3mmol/L ATP組的熒光強度(P<0.01)。說明NaHS及KN-62
14、都能明顯對抗ATP誘導的膜孔形成,降低細胞對YO-PRO-1遙透。
3 NaHS對ATP誘導的大鼠小膠質細胞P2X7受體表達的影響
Western blotting結果顯示,3mmol/L ATP處理3h后,大鼠小膠質細胞P2X7受體蛋白表達明顯增加。而先給予200μmol/L NaHS預孵育后再加入ATP,P2X7受體蛋白表達水平較單純ATP處理組相比明顯下降(P<0.05),顯示NaHS能抑制ATP誘導的P2X7
15、受體蛋白的表達。
4 NaHS對ATP-LPS激活的大鼠小膠質細胞釋放IL-1β的影響
檢測細胞上清液內IL-1β水平來反映大鼠小膠質細胞的激活。結果單純ATP處理組或LPS處理組細胞上清液內IL-1β水平與對照組相比均無明顯差異(P>0.05)。而ATP+LPS組無論與單純ATP處理組相比還是與LPS處理組相比,IL-1β水平均有明顯升高(P<0.05)。但在ATP+LPS組處理前30min加入NaHS,細胞上清液
16、IL-1β水平則明顯低于ATP+LPS組(P<0.05)。表明ATP或LPS均不能引起大鼠小膠質細胞IL-1β的釋放,而ATP與LPS的聯(lián)合作用則能激活大鼠小膠質細胞,釋放IL-1β,NaHS預孵育能抑制ATP與LPS聯(lián)合引發(fā)的大鼠小膠質細胞的激活及IL-1的釋放。
結論:
胞外高濃度的ATP可降低大鼠小膠質細胞活力、上調P2X7受體表達、促進膜孔形成;ATP與LPS聯(lián)合作用可激活大鼠小膠質細胞,增多IL-1β的釋放
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- H2S對大鼠缺血性神經損傷的保護作用及機制研究.pdf
- H2S對大鼠胃缺血再灌注損傷的保護作用及其機制研究.pdf
- H2S對血管癡呆大鼠腦組織海馬神經細胞的保護作用.pdf
- 外源性H2S對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用及其機制研究.pdf
- H2S對高糖誘導的人臍靜脈內皮細胸損傷的保護作用及其機制.pdf
- H2S對缺血再灌注所致神經元損傷的保護作用.pdf
- H2S對甲醛損傷大鼠學習記憶和認知功能的改善作用及其機制.pdf
- H2S對心肺復蘇后腦損傷的作用及其機制.pdf
- H2S預處理對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用及其機制研究.pdf
- H2S對脂多糖誘導PC12細胞凋亡的拮抗作用及其機制.pdf
- 高濃度氧誘導在體大鼠腦損傷的探討.pdf
- 漏蘆對H2O2誘導的HepG-2細胞損傷的保護作用.pdf
- AMPK活化在H2S拮抗阿霉素誘導大鼠H9c2心肌細胞凋亡中的作用.pdf
- DHEA對H2O2誘導的原代大鼠睪丸間質細胞氧化損傷的保護及修復作用研究.pdf
- 黃連對LPS誘導的大鼠肝細胞損傷的保護作用研究.pdf
- 氣體分子H2S對血管性癡呆模型大鼠的神經保護作用機制.pdf
- 外源性H2S對新生大鼠高氧肺損傷iNOS-NO體系的影響.pdf
- 高濃度氧誘導小膠質細胞活化致未成熟腦損傷及脂多糖致敏效應的研究.pdf
- Souliene A對小膠質細胞介導的神經元損傷的保護作用.pdf
- H2S在SO2誘導蠶豆氣孔運動與保衛(wèi)細胞死亡中的作用.pdf
評論
0/150
提交評論