吖啶黃的新靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)及其在腫瘤治療中的應(yīng)用研究.pdf

1、目的：吖啶黃作為抗菌藥物曾在臨床上廣泛使用，而近年來其抗腫瘤活性多見諸于報(bào)道，被認(rèn)為是一類具有前景的潛在抗腫瘤藥物。然而針對(duì)吖啶黃抗腫瘤作用機(jī)制的研究并不多見，更缺乏分子靶點(diǎn)的確證，這極大地限制了吖啶黃在抗腫瘤領(lǐng)域中的進(jìn)一步應(yīng)用。本部分研究將以吖啶黃作為研究對(duì)象，通過構(gòu)建基于探針的pull-down系統(tǒng)，探討吖啶黃直接結(jié)合的蛋白以及潛在的作用靶點(diǎn);在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)以吖啶黃為主的聯(lián)合用藥方案，考察合用方案的體內(nèi)外抗腫瘤作用，并深入闡述其分

2、子機(jī)制及影響因素。課題旨在發(fā)現(xiàn)吖啶黃全新的作用靶點(diǎn)，指導(dǎo)其在腫瘤治療領(lǐng)域的臨床應(yīng)用，為腫瘤治療提供可行的聯(lián)合用藥策略;也為開發(fā)具有類似結(jié)構(gòu)的新型抗腫瘤藥物提供科學(xué)依據(jù)與思路。
　　方法：⑴Pull-down實(shí)驗(yàn)與HPLC-MS/MS檢測(cè)分析瓊脂糖珠所結(jié)合的蛋白；⑵Western blotting考察藥物或其他刺激因素作用后細(xì)胞內(nèi)蛋白水平變化；⑶CCK-8及SRB染色法評(píng)價(jià)藥物作用下的腫瘤細(xì)胞增殖能力；⑷PI單染、AnnexinⅤ-

3、PE/7-AAD染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)以及DAPI染色法考察細(xì)胞凋亡；⑸中性彗星實(shí)驗(yàn)、抗53BP1免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞DSBs損傷及修復(fù)情況；⑹建立人源性荷Hela宮頸癌裸小鼠模型和荷HCT116結(jié)腸癌裸小鼠模型，檢測(cè)藥物的體內(nèi)協(xié)同抗腫瘤作用；⑺TUNEL法檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)凋亡情況；⑻運(yùn)用siRNA技術(shù)沉默p21基因表達(dá)；⑼基因表達(dá)譜芯片分析相關(guān)差異基因的表達(dá)。
　　結(jié)果：①吖啶黃的靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)及對(duì)DNA-PK的抑制作用研究:構(gòu)建并驗(yàn)證了連

4、接有吖啶黃的NHS活化瓊脂糖珠(ACF-NHS)用于分離吖啶黃結(jié)合蛋白(acriflavine-bound proteins)的實(shí)驗(yàn)體系，經(jīng)HPLC-MS/MS分析，綜合考慮吖啶黃在細(xì)胞內(nèi)的核漿分布，確定包括DNA-PKcs在內(nèi)的若干核蛋白為吖啶黃靶點(diǎn)蛋白;計(jì)算機(jī)模擬分子對(duì)接、體外酶活性及細(xì)胞水平上的放射線/熱刺激造模實(shí)驗(yàn)證實(shí)吖啶黃能夠直接結(jié)合于DNA-PKcs的激酶區(qū)域，進(jìn)而抑制其激酶活性。②吖啶黃與美法侖協(xié)同抗腫瘤作用的研究:烷化劑

5、美法侖能夠引起DNA-PKcs活性增加，抑制DNA-PKcs活性能夠增強(qiáng)美法侖作用;吖啶黃與美法侖聯(lián)合用藥能顯著增加后者抑制細(xì)胞增殖的作用，增加caspase依賴的細(xì)胞凋亡，相比于同時(shí)給藥，吖啶黃與美法侖的序貫給藥具有更強(qiáng)的協(xié)同效果;機(jī)制上，吖啶黃能夠逆轉(zhuǎn)美法侖單用所引起的DNA-PKcs激活，從而抑制NHEJ修復(fù)，明顯累積DNA雙鏈斷裂(DSBs)，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡;這一作用與吖啶黃其他潛在靶點(diǎn)無關(guān);在荷Hela官頸癌裸鼠模型以及荷H

6、CT116結(jié)腸癌裸鼠模型中吖啶黃與美法侖表現(xiàn)出良好的體內(nèi)協(xié)同抗腫瘤作用。③p53影響吖啶黃協(xié)同美法侖抗腫瘤作用的研究:GSEA分析顯示，吖啶黃與美法侖合用顯著影響p53信號(hào)通路;體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)p53功能或表達(dá)缺失將干擾兩藥協(xié)同抗腫瘤作用;吖啶黃與美法侖聯(lián)合用藥后會(huì)上調(diào)p53下游凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)促進(jìn)調(diào)控細(xì)胞周期的p21基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)，p21通過抑制CDK2磷酸化進(jìn)而逆轉(zhuǎn)美法侖單用所誘導(dǎo)的S期阻滯;敲除p21可使吖啶黃與美法侖協(xié)