細(xì)菌代謝產(chǎn)物在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用研究.pdf

1、腫瘤嚴(yán)重威脅著人類生命健康。傳統(tǒng)的化療、放療和手術(shù)方法存在著各種問題，因此迫切需要尋找新的治療手段，腫瘤免疫治療即是這些新的治療手段之一。 實(shí)驗(yàn)的第一部分研究了金黃色葡萄球菌腸毒素C(SEC)的抗腫瘤作用。作為強(qiáng)大的T細(xì)胞激活劑，葡萄球菌腸毒素(SE)治療腫瘤有著潛在的應(yīng)用價(jià)值。本研究考察了SEC在體內(nèi)外的抗腫瘤活性。體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，SEC在較低劑量下激活的人外周血淋巴細(xì)胞即可以抑制人多種類型腫瘤細(xì)胞的生長。在體內(nèi)系統(tǒng)給予SE

2、C可以顯著性地抑制小鼠腫瘤細(xì)胞生長：對兔的腫瘤也有一定程度的抑制，同時(shí)病理結(jié)果顯示SEC可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞壞死及腫瘤區(qū)域淋巴細(xì)胞浸潤，抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。以上臨床前結(jié)果提示SEC是一個(gè)較有前景的抗腫瘤候選生物制劑，有待于進(jìn)行下一步的臨床研究。 雖然超抗原有很好的臨床療效，但其對T細(xì)胞的非選擇性激活使得腫瘤細(xì)胞特異性的CTL含量很少。因此，如果將超抗原與腫瘤特異性抗原結(jié)合使用，理論上應(yīng)該能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生更多的腫瘤特異性的CTL。在實(shí)

3、驗(yàn)的第二部分，為了評價(jià)腸毒素能否增強(qiáng)NY-ESO-1特異的細(xì)胞免疫應(yīng)答，首先構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NY-ESO-1的小鼠B16細(xì)胞系。通過重疊PCR擴(kuò)增得到人NY-ESO-1全長編碼序列，構(gòu)建真核表達(dá)載體NY-ESO-1-pcDNA3.1(+)，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染鼠黑色素瘤B16細(xì)胞，經(jīng)RT-PCR及免疫印跡法鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞中NY-ESO-1的表達(dá)，經(jīng)過G418篩選后，得到了能表達(dá)人NY-ESO-1蛋白的B16株。 同時(shí)，將NY-ESO-

4、1基因克隆至PEF-28a(+)原核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni柱親和純化獲得NY-ESO-1蛋白。為了觀察超抗原對NY-ESO-1特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的增強(qiáng)作用，將小鼠進(jìn)行如下分組：NY-ESO-1+SEA/SEB組、NY-ESO-1組、SEA/SEB組和PBS組。對不同組小鼠分別進(jìn)行免疫后，獲取脾淋巴細(xì)胞，經(jīng)NY-ESO-1-B16細(xì)胞裂解物刺激后，NY-ESO-1+SEA/SEB組、NY-E

5、SO-1組均能夠誘導(dǎo)出針對NY-ESO-1-B16細(xì)胞特異性的CTL殺傷活性，且殺傷率分別為44.33％，44.34％，幾乎相同，這與ELISPOT的結(jié)果相符。ELISPOT結(jié)果顯示，各組小鼠在免疫后，以NY-ESO-1蛋白體外再次刺激脾淋巴細(xì)胞，NY-ESO-1+SEA/SEB組、NY-ESO-1組分泌IFN-γ的T細(xì)胞數(shù)量較接近，分別為134.81和157.44。 與體外結(jié)果相似，在小鼠體內(nèi)同樣沒有觀察到超抗原對NY-ESO

6、-1特異的細(xì)胞免疫的增強(qiáng)作用。分別對NY-ESO-1+SEMSEB組、NY-ESO-1組、SEA/SEB組和PBS組小鼠進(jìn)行免疫后接種腫瘤，結(jié)果顯示NY-ESO-1組小鼠的抑瘤率最高，與PBS組相比有顯著性差異，而NY-ESO-1+SEA/SEB組的抑瘤率低于單獨(dú)的NY-ESO-1組。從體內(nèi)外的結(jié)果來看，金黃色葡萄球菌腸毒素沒有起到預(yù)期的增強(qiáng)NY-ESO-1特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用。具體原因有待進(jìn)一步研究。腫瘤特異性的CTL對腫瘤免疫治

7、療至關(guān)重要，以往的研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分支桿菌熱休克蛋白65與抗原肽結(jié)合能有效激活抗原特異的CTL。實(shí)驗(yàn)第三部分研究了Hsp65對NY-ESO-1特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的增強(qiáng)作用。首先構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒HSP65-NY-ESO-1-PET28a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳及Westen blot鑒定。結(jié)果顯示構(gòu)建的重組原核表達(dá)質(zhì)粒HSP65-NY-ESO-1-PET28a能在大腸桿菌中高效、可溶的表達(dá)H

8、SP65-NY-ESO-1融合蛋白。 將小鼠分為HSP65-NY-ESO-1組，NY-ESO-1組和PBS組進(jìn)行免疫，同研究二進(jìn)行體外ELISPOT實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，HSP65-NY-ESO-1組小鼠脾淋巴細(xì)胞體外接受同樣抗原刺激后分泌IFN-γ的T細(xì)胞數(shù)為93.56，是NY-ESO-1組的2倍，與PBS組相比有顯著性差異；LDH實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，HSP65-NY-ESO-1組小鼠脾淋巴細(xì)胞對NY-ESO-1陽性的B16細(xì)胞的特異