Lysine-cyclic RGD肽的設(shè)計及其運用于選擇性細胞滯留技術(shù)的應(yīng)用基礎(chǔ)研究.pdf

1、背景及目的:理想的骨修復(fù)材料一直是骨外科的亟需品，然而目前的研究遭遇重重障礙，最具希望的骨組織工程也由于其種子細胞、支架材料和構(gòu)建策略三大要素分別面臨諸多難題而致使其發(fā)展應(yīng)用遭遇瓶頸。選擇性細胞滯留技術(shù)是傳統(tǒng)骨組織工程在構(gòu)建策略上的一種改良手段，這種改良不僅可以突破傳統(tǒng)骨組織工程在構(gòu)建策略上的關(guān)鍵性難題，并且由于采用自體骨髓的細胞成分作為即用型種子細胞，若策略得當(dāng)，可同時解決傳統(tǒng)骨組織工程種子細胞在擴增周期、潛在致瘤性、免疫原性以及倫理

2、學(xué)等方面諸多棘手的難題，這樣一來，支架材料的性能便成為了選擇性細胞滯留技術(shù)最為關(guān)鍵的決定因素。由于選擇性細胞滯留技術(shù)旨在盡量縮短構(gòu)建時間以滿足臨床上對骨修復(fù)材料隨取隨用的要求，如此其要求的支架材料需要在性能上兼顧生物相容性、骨誘導(dǎo)性和快速的細胞粘附能力。基于以上背景，我們設(shè)想將成熟的促粘修飾物賴氨酸序列與具備特異性粘附能力和成骨誘導(dǎo)能力的RGD序列相結(jié)合，設(shè)計制備出Lysine-cyclic RGD(LcRGD)肽，以物理電荷和生物配基

3、相結(jié)合的方式協(xié)調(diào)非特異性粘附與特異性粘附，并在提高選擇性細胞滯留技術(shù)中支架材料對骨髓中細胞快速粘附能力的同時兼顧成骨誘導(dǎo)能力。
　　方法:(1)查閱文獻，根據(jù)對合成物目標(biāo)性能的實際要求，選用了具備較長半衰期、較好細胞粘附性并兼顧對MSCs成骨誘導(dǎo)性能的c(RGDfK)環(huán)五肽作為主體結(jié)構(gòu)，再加上20K的賴氨酸序列以增強其非特異性粘附能力，最終課題組設(shè)計了LcRGD肽的結(jié)構(gòu)，并以固態(tài)合成法和HPLC法等進行了制備、純化和驗證，以LcR

4、GD肽對DBM進行了修飾并以激光共聚焦顯微鏡、環(huán)境掃描電鏡、能譜分析等方法驗證了修飾的有效性和穩(wěn)定性。(2)以離心細胞粘附實驗、CCK-8法、WesternBlot、qPCR、堿性磷酸酶活性檢測等方法在體外檢測了LcRGD肽對間充質(zhì)干細胞的粘附性能和成骨誘導(dǎo)能力。(3)以流式細胞儀、裸鼠股骨旁成骨實驗、影像學(xué)方法和病理學(xué)方法檢測了DBM/LcRGD支架材料對骨髓中有核細胞的粘附能力和體內(nèi)成骨能力。
　　結(jié)果:(1)課題組成功設(shè)計和

5、獲取了高純度的LcRGD肽，環(huán)境掃描電鏡觀察到經(jīng)LcRGD肽修飾的DBM表面粗糙度有所提高，能譜分析亦顯示LcRGD肽被成功地修飾于DBM表面。以帶FITC熒光的LcRGD肽修飾DBM后以激光共聚焦顯微鏡進行三維重建，證實了修飾的有效性，隨后將DBM/LcRGD-FITC支架材料以PBS緩沖液進行高載荷的模擬富集后再次以激光共聚焦顯微鏡進行三維重建，結(jié)果顯示LcRGD-FITC肽經(jīng)過較高強度的沖刷后仍然較為穩(wěn)定地修飾于DBM表面。(2)

6、離心細胞粘附實驗結(jié)果顯示，相對于普通cRGD肽修飾的蓋玻片和未經(jīng)修飾的蓋玻片，LcRGD肽修飾的蓋玻片對體外培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞在早期便具有更強的粘附能力。CCK-8實驗證實了以MSCs細胞懸液模擬選擇性細胞滯留技術(shù)后，相對于DBM/cRGD和DBM支架材料，DBM/LcRGD支架材料滯留了更多MSCs，并且MSCs在DBM/LcRGD支架材料上的增殖最先到達峰頂密度。將以MSCs細胞懸液模擬選擇性細胞滯留技術(shù)后DBM/LcRGD、DBM

7、/cRGD和DBM支架材料以成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)后以qPCR、WesternBlot和堿性磷酸酶活性檢測試劑盒進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DBM/LcRGD組具有更高的Runx2、ALP、OPN和OCN的基因表達水平和蛋白表達水平，以上結(jié)果表明LcRGD肽具有更好的誘導(dǎo)MSCs成骨分化的能力。(3)以選擇性細胞滯留技術(shù)采用健康成人骨髓對DBM/LcRGD、DBM/cRGD和DBM支架材料進行富集，流式細胞儀結(jié)果顯示DBM/LcRGD組對骨髓中有

8、核細胞、單核細胞、CD90+/CD105+雙陽性細胞以及CD34+細胞的富集效率顯著高于對照組并展現(xiàn)出了一定的靶向粘附能力。以裸鼠股骨旁成骨實驗對DBM/LcRGD和DBM支架材料進行體內(nèi)實驗觀察，影像學(xué)和病理學(xué)方法均顯示DBM/LcRGD組具有更好的體內(nèi)成骨能力。
　　結(jié)論:以設(shè)計制備的LcRGD肽修飾DBM所得的DBM/LcRGD支架材料具有良好的生物相容性、細胞粘附能力和成骨誘導(dǎo)性能，在運用于選擇性細胞滯留技術(shù)時其對骨髓中細