兩類未知dsRNA序列研究及其功能分析.pdf

1、利用經(jīng)改進(jìn)的單引物擴(kuò)增法(M-SPAT)對所獲得的未知dsRNA條帶進(jìn)行克隆測序、序列分析及其功能預(yù)測，進(jìn)而獲取所得dsRNA的一系列相關(guān)信息。dsRNA新序列及dsRNA新病毒的發(fā)現(xiàn)及研究，為dsRNA病毒種類和數(shù)量的研究積累信息。本論文對報春花和某鏈格孢屬真菌B中的dsRNA進(jìn)行了序列研究和功能分析。
　　 從杭州地區(qū)采集有黃邊癥狀的栽培觀賞性植物報春花，通過從葉組織中抽提dsRNA并進(jìn)行1％瓊脂糖電泳，檢測出大小約230.

2、bp的dsRNA條帶。利用經(jīng)修改的單引物擴(kuò)增法(Modifie.Singl.Prim.Amplificatio.Technique，M-SPAT)獲得兩條dsRNA序列，dsR1和dsR2，大小分別為239.bp和234.bp，在Genbank數(shù)據(jù)庫中的序列號分別為EU195326和EU195327。末端非編碼區(qū)(Untranslate.Region.UIR)分析結(jié)果顯示，RNA1與RNA2的5，端UTR高度保守，相似度為90.2％。R

3、NA1與RNA2的3’端UTR各有一段3.bp和7.b.poly(A)結(jié)構(gòu)(中間有個別其它堿基)；在靠近各自O(shè)RF終止密碼子處兩者有共同的序列(5'-GAAAUUUU-3')。dsR1的最大開放閱讀框(ope.readin.frame，ORF)編碼一個由723個氨基酸組成的蛋白，dsR2的最大ORF編碼一個由673個氨基酸組成的蛋白，兩者分子量大小分別為84 kDa和74 kDa。NCBI數(shù)據(jù)庫中BLASTP程序搜索及相似序列比對結(jié)果顯

4、示，dsR1和dsR2推測編碼的蛋白分別為某未知雙分病毒科病毒成員的RNA聚合酶(RN.dependen.RN.polymerase，RdRp)和外殼蛋白(capsi.protein.CP)。另外，病毒粒子提取及電鏡觀察顯示，病毒粒子為直徑約3.nm的球形結(jié)構(gòu)。從病毒粒子中分離病毒dsRNA，與直接從植物葉組織中提取的dsRNA同時電泳，結(jié)果顯示兩者大小基本一致。斑點雜交結(jié)果也表明dsR1和dsR2來源于病毒。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，報春花

5、中發(fā)現(xiàn)的新病毒與雙分病毒科病毒成員聚在一起。綜上，報春花中分離的dsR1和dsR2為一新發(fā)現(xiàn)的雙分病毒科病毒的基因組。
　　 通過杭州一點紅蘿卜葉組織中內(nèi)生真菌的分離實驗，獲得三株真菌，標(biāo)記為A、B、C，分別從中提取dsRNA，并克隆測序，檢測真菌中是否存在與蘿卜中的dsRNA條帶相似或相關(guān)的dsRNA。將三株真菌在PDB培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)后從菌體中提取dsRNA，發(fā)現(xiàn)真菌B中含有六條dsRNA條帶?？寺y序得到三條序列，AltR

6、1、AltR2和AltR3，Genbank登錄號分別為FJ595830、FJ595831、FJ595832，大小分別為223.bp、136.bp和103.bp，與蘿卜葉組織中提取的dsRNA已知序列無任何相似性。UTR分析顯示，AltR1和AltR2的5，UTR相似度為64.8％，AltR2和AkR3的5'UTR相似度為54.1％。AltR1和AltR2的3'UTR相似度為64.8％，AltR2與AltR3的3'UTR的相似度為58.6

7、％，且AltR3的3'UTR長度明顯長于AltR1和AltR2。ORF分析顯示，AkR1、AltR2和AltR3的最大ORF分別編碼分子量為74 kDa、41 kDa和19 kDa蛋白，NCB.BLASTP搜索結(jié)果顯示，AltR1、AltR2和AltR3的ORF編碼的蛋白序列與dsRNA復(fù)制或包被功能無關(guān)，而可能與改變真菌信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)。RT-PCR驗證了所測序列與真菌B中提取的dsRNA序列的一致性。另外，真菌ITS序列分析及形態(tài)學(xué)

8、研究表明，真菌B為鏈格孢屬(Alternaria)真菌。
　　 綜上所述，我們在報春花中新發(fā)現(xiàn)了一種雙分病毒科病毒并測定了基因組序列；初步鑒定了真菌B為鏈格孢屬真菌，并確定了其所包含的三條dsRNA片段的序列信息。報春花中dsRNA新病毒的發(fā)現(xiàn)，為植物中dsRNA病毒的種類和數(shù)量的研究積累了一定的信息，同時，由于其在進(jìn)化分析中表現(xiàn)出的特異性，也為以后植物與真菌中dsRNA病毒的進(jìn)化關(guān)系研究提供了相關(guān)信息；真菌中三條dsRNA序列