MG53合成修飾障礙抑制燒傷后肌膜修復(fù)導(dǎo)致骨骼肌代謝紊亂的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　觀察燒傷后骨骼肌細(xì)胞膜完整性變化，探索MG53在燒傷后骨骼肌膜修復(fù)障礙中的作用及其分子機(jī)制。
　　方法:
　　一、體內(nèi)實(shí)驗(yàn):按隨機(jī)數(shù)字表將216只雄性健康BALB/C小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照(C)組，燒傷對(duì)照(B)組，燒傷+胰島素治療(Ⅰ)組。C組只給予麻醉和剃毛，37℃水9秒假燙傷;B、C組給予90℃水燙傷9秒，造成30％體表面積Ⅲ度燒傷。傷后各組均給予正常飲食及飲水，Ⅰ組于燒傷后6h（麻醉清醒后）皮下注射甘

2、精胰島素（5UI/kg.d），B組于燒傷后6h皮下注射等體積生理鹽水，C組皮下注射等體積生理鹽水，每天1次。觀察傷前及傷后2、5、10和14天各項(xiàng)指標(biāo)的變化。
　?。ㄒ唬┩ㄟ^腹腔注射伊文思藍(lán)(EBD)，檢測(cè)肌細(xì)胞內(nèi)EBD熒光強(qiáng)度和EBD含量，反映肌膜完整性;
　　（二）采用Treadmill實(shí)驗(yàn)和腹腔注射EBD，通過對(duì)比運(yùn)動(dòng)前后肌細(xì)胞內(nèi)EBD熒光強(qiáng)度和EBD含量反映肌膜修復(fù)能力。采用機(jī)械分離和酶消化法，分離單條肌纖維。用紫外

3、線破壞肌纖維膜，檢測(cè)流入肌絲的FM1-43熒光強(qiáng)度以反映肌纖維膜的自我修復(fù)能力;
　　（三）采用甘油-3-磷酸激酶氧化(GK-GPO)法，測(cè)定甘油三酯(TG)含量;
　　（四）采用treadmill實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)小鼠小腿肌肉耐力;
　　（五）采用還原性免疫印跡(WB)法檢測(cè)骨骼肌中MG53、蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CHOP)、腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK-a)、p-AMPK-a、胰島素受體底

4、物1(IRS-1)與細(xì)胞因子信號(hào)抑制物（SOCS-1和SOCS-3）蛋白含量;采用非還原性免疫印跡法檢測(cè)MG53蛋白多聚體含量。
　　二、體外實(shí)驗(yàn):體外培養(yǎng)小鼠骨骼肌前體細(xì)胞株C2C12，并誘導(dǎo)分化48h。
　?。ㄒ唬?shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照(Control)組，胰島素(INS)組，胰島素+PI3K抑制劑(INS+LY294002)組。分別采用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和免疫印跡(WB)法檢測(cè)MG53 mRNA和蛋白的表達(dá)量;

5、　　（二）實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照(Control)組，腺苷酸激活蛋白激酶激動(dòng)劑(AICAR)組。分別采用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和免疫印跡(WB)法檢測(cè)MG53 mRNA和蛋白的表達(dá)量;
　?。ㄈ┙齻h(huán)境模型，實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組（Control）組，燒傷血清組(BS)，燒傷血清+STAT抑制劑(BS+S3I-201)組。采用免疫印跡(WB)法和免疫熒光(IF)法檢測(cè)C2C12細(xì)胞中IRS-1、SOCS-1和SOCS-3蛋白表達(dá)的

6、變化。
　　結(jié)果:
　　1.燒傷后骨骼肌膜完整性的變化及胰島素對(duì)其的影響。與正常對(duì)照組相比，傷后第14天腓腸肌中EBD含量顯著升高(P＜0.05)。與燒傷對(duì)照組相比，胰島素治療組小鼠腓腸肌中EBD含量有所減少(P＜0.05)。
　　2.燒傷后骨骼肌膜自我修復(fù)功能的變化及胰島素對(duì)其的影響。與正常對(duì)照組相比，燒傷對(duì)照組小鼠傷后第14天運(yùn)動(dòng)后腓腸肌中EBD明顯增加(P＜0.05)。與正常對(duì)照組相比，燒傷對(duì)照組小鼠傷后第14天

7、肌纖維內(nèi)FMI-43明顯增加(P＜0.05)。與燒傷對(duì)照組相比，胰島素治療組小鼠運(yùn)動(dòng)前后腓腸肌中EBD增量顯著降低(P＜0.05)，肌纖維內(nèi)FMI-43含量顯著降低(P＜0.05)。
　　3.燒傷后骨骼肌重量，脂質(zhì)沉積和耐力的變化及胰島素對(duì)其的影響。與正常對(duì)照組相比，燒傷對(duì)照組小鼠傷后第5、10和14天小鼠腓腸肌重量明顯降低(P＜0.05)，傷后10、14天腓腸肌中TG明顯升高(P＜0.05)，傷后2、5、10和14天小腿肌耐力均

8、明顯降低(P＜0.05);與燒傷對(duì)照組相比，胰島素治療組小鼠腓腸肌重量，TG含量有所降低(P＜0.05)，小腿肌耐力有所增加(P＜0.05)。
　　4.燒傷后骨骼肌中MG53表達(dá)和多聚化的變化及胰島素對(duì)其的影響。與正常對(duì)照組相比，燒傷組小鼠在傷后14天腓腸肌中MG53表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。燒傷組小鼠傷后5、10和14天腓腸肌中MG53多聚體顯著減少(P＜0.05)。與燒傷對(duì)照組相比，胰島素治療組燒傷小鼠傷后14天腓腸肌中M

9、G53表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，傷后5天腓腸肌MG53多聚體明顯增加(P＜0.05)，而傷后10和14天MG53多聚體無明顯變化(P＞0.05)。
　　5.燒傷后骨骼肌中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)簽蛋白PDI、CHOP表達(dá)變化及胰島素對(duì)其的影響。與正常對(duì)照組相比，燒傷組小鼠傷后5、10和14天腓腸肌中PDI表達(dá)顯增加(P＜0.05)。燒傷組小鼠傷后5、10和14天腓腸肌中CHOP顯著增加(P＜0.05)。與燒傷對(duì)照組相比，胰島素治療組小鼠腓

10、腸肌中PDI和CHOP表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)。
　　6.胰島素通過胰島素信號(hào)通路促進(jìn)MG53合成，AICAR對(duì)MG53合成無明顯影響。與正常對(duì)照組相比，胰島素可使C2C12中MG53 mRNA水平和蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05)。與胰島素組相比，胰島素+PI3K抑制劑作用下，C2C12中MG53 mRNA水平和蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。與正常對(duì)照組相比，AICAR組C2C12中MG53mRNA水平和蛋白表達(dá)無明顯

11、變化(P＞0.05)。
　　7.燒傷后骨骼肌AMPK-a、p-AMPK-a、 IRS-1、SOCS-1和SOCS-3表達(dá)變化。與正常對(duì)照組相比，燒傷組小鼠腓腸肌中在燒傷后2-14天AMPK-a、p-AMPK-a表達(dá)均降低(P＜0.05);燒傷組小鼠腓腸肌中在燒傷后2-14天IRS-1表達(dá)均降低(P＜0.05);燒傷后2、5和10天腓腸肌中SOCS-1表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，SOCS-3在燒傷后10、14天顯著升高(P＜0.0

12、5)。
　　8.燒傷后血清刺激下C2C12中SOCS-1、SOCS-3和IRS-1表達(dá)變化，及SOCS對(duì)IRS-1表達(dá)的影響。與正常對(duì)照組相比，在燒傷血清作用下C2C12中SOCS-1和SOCS-3表達(dá)明顯升高，而IRS-1明顯減低(P＜0.05);與燒傷血清組相比，燒傷血清+抑制劑S3I-201組C2C12中SOCS-1和SOCS-3表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，而IRS-1表達(dá)明顯升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:

13、>　　1.嚴(yán)重?zé)齻蠹∧ぷ晕倚迯?fù)功能障礙引起的肌膜破損是骨骼肌萎縮、無力和脂質(zhì)沉積的重要原因。
　　2.燒傷后骨骼肌中MG53表達(dá)缺陷和寡聚化異常是肌膜自我修復(fù)功能障礙的主要原因。
　　3.燒傷后骨骼肌中SOCS激活引起的SOCS-1、SOCS-3表達(dá)升高可導(dǎo)致IRS-1降解，產(chǎn)生胰島素抵抗，與傷后骨骼肌中MG53缺乏密切相關(guān)。
　　4.燒傷后骨骼肌中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)引起PDI功能異常是導(dǎo)致MG53寡聚化障礙的重要