MiR-146b-5p對甲狀腺乳頭狀癌細胞TPC-1相關生物學特性的影響研究.pdf

1、背景：
　　MicroRNAs（小分子RNA，miRNAs）是一類全長約為21~25個核苷酸的非編碼單鏈小RNA分子，miRNA可以識別特定的靶mRNA，轉錄以后信使RNA可以調節(jié)基因的表達水平，從而參與調控細胞的生長、增殖、分化、凋亡等生命活動。內分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤為甲狀腺癌，其在惡性腫瘤中約占3％，已躍居頭頸部惡性腫瘤的首位，女性發(fā)病較多。近年來各國報道甲狀腺癌發(fā)病率的增長多以PTC為主。由于PTC早期多無明顯癥狀，常常

2、導致患者就診時已經(jīng)有淋巴結轉移或已侵犯周圍器官和組織。因此，探索PTC有效的治療靶點、尋找更安全有效的治療途徑一直是提高PTC生存率和生存質量所亟待解決的難題。
　　在本實驗前期的研究中，應用高通量的 MicroRNA微陣列篩選不同分期的PTC組織和癌旁正常組織中差異表達的MicroRNA時發(fā)現(xiàn)，miR-146b-5p在早期和中晚期PTC組織中均呈明顯高表達，同時隨著腫瘤分期的增加，其表達水平有升高的趨勢，提示其在PTC發(fā)生、發(fā)展

3、和轉移過程中起著重要作用。
　　MiR-146b位于10q24.32，與miR-146a具有高度的序列同源性。He及Sheu等通過基因芯片技術及RT-PCR方法研究發(fā)現(xiàn)miR-146b在PTC組織中過表達。Kim、Xing及Chou等發(fā)現(xiàn)miR-146b在BRAF基因突變組織中表達明顯升高， BRAF基因突變與PTC的侵襲性有關，這可能是miR-146b在PTC中過表達的一個分子機制。但目前尚未有關于miRNA-146b-5p與P

4、TC細胞生物學影響及相關機制的相關報道，通過本課題的研究，可望獲得miR-146b-5p對PTC的生物學行為影響的可靠證據(jù)，為確立miR-146b-5p作為PTC診斷和預后監(jiān)測的生物學指標及治療靶點奠定理論基礎。
　　本次實驗通過對甲狀腺乳頭狀癌細胞TPC-1細胞株穩(wěn)定轉染使miR-146b-5p過表達，之后通過 CCK-8、劃痕實驗、transwell小室侵襲實驗以及流式細胞儀檢測對比轉染前后PTC的增殖、凋亡、周期以及遷移、侵

5、襲能力的變化。從而探討miR-146b-5p過表達與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)展的關系及miR-146b-5p在甲狀腺乳頭狀癌中的作用機制。
　　目的：
　　本實驗通過慢病毒載體構建和慢病毒包裝并通過慢病毒侵染試驗，使得hsa-mir-146b-5p在甲狀腺乳頭狀癌細胞 TPC-1細胞株中得到穩(wěn)定高表達，這個試驗為接下來進一步研究 miR-146b-5p過表達對甲狀腺乳頭狀癌細胞 TPC-1增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學特性的影響打下

6、堅實的基礎。
　　方法：
　　1.慢性毒質粒的構建：
　?。?）構建miR-146b-5p過表達慢病毒質粒
　　（2）將過表達慢病毒質粒轉染人甲狀腺乳頭狀癌細胞 TPC-1，獲取miR-146b-5p穩(wěn)定過表達的細胞單克隆
　　2. miR-146b-5p對甲狀腺乳頭狀癌細胞生物學行為的影響
　?。?）觀察 miR-146b-5p過表達對 TPC-1細胞增殖的影響：cck-8法檢測miR-146b-5

7、p過表達后可以明顯促進TPC-1細胞的增殖，實驗組和對照組的細胞數(shù)均有增加，但實驗組的細胞增殖更加明顯（P<0.05）。
　?。?）分析miR-146b-5p過表達對TPC-1細胞周期和凋亡的影響：通過流式細胞儀分析技術，可以看到實驗組和對照組的細胞凋亡率之間有明顯差異，實驗組細胞凋亡率減少更為明顯。
　?。?）研究miR-146b-5 p過表達對TPC-1細胞遷移能力的影響:劃痕實驗觀察過表過miR-146b-5p的細胞，

8、細胞遷移能力明顯增強，transwell小室侵襲實驗觀察細胞的侵襲能力明顯增強。
　　結果
　　（1）經(jīng)慢病毒包裝侵染將miR-146b-5p轉染至甲狀腺乳頭狀癌細胞TPC-1中，細胞數(shù)都有所增加，但轉染組的TPC-1細胞增殖的更加明顯。（P<0.05）。
　?。?）CCK-8法和流式細胞儀技術檢測轉染miR-146b-5p基因后可以明顯促進甲狀腺乳頭狀癌細胞TPC-1的增殖，實驗組和對照組的TPC-1細胞數(shù)都有所增加

9、，但實驗組的TPC-1細胞數(shù)增加更加顯著。（P<0.05）。
　?。?）流式細胞儀技術檢測細胞凋亡率：實驗組和空載組、對照組相比較細胞凋亡減少明顯，差異顯著。（P<0.05）。
　?。?）劃痕實驗觀察轉染miR-146b-5p后穩(wěn)定轉染miR-146b-5p中，24h、48h、72h遷移細胞數(shù)量均高于空載體組和對照組，轉染miR-146b-5p后TPC-1細胞的遷移細胞明顯增加（P<0.05）。transwell小室侵襲實驗

10、觀察24h、48h、72h的穿膜細胞數(shù)，轉染miR-146b-5p后TPC-1細胞的穿膜細胞數(shù)明顯增多（P<0.05）。
　　結論：
　　經(jīng)過慢病毒穩(wěn)定轉染miR-146b-5p后，轉染后細胞經(jīng)過CCK-8、劃痕實驗、以及流式細胞儀技術檢測：TPC-1細胞的增殖得到促進，凋亡減少，遷移、侵襲能力明顯增強。提示在 TPC-1細胞中 miR-146b-5p與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)展相關，miR-146b-5p的過表達可以促進 TPC