MiR-146b-5p對(duì)人宮頸癌細(xì)胞系Caski生物學(xué)行為的影響及作用機(jī)制的初步探討.pdf

1、背景：宮頸癌是我國(guó)最常見的婦科惡性腫瘤之一。隨著人們性觀念及性行為的改變，我國(guó)宮頸癌的發(fā)病呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)。盡管宮頸癌篩查項(xiàng)目在不斷普及，每年仍有大量宮頸癌新發(fā)病例及死亡病例。現(xiàn)已明確，高危型人乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的主要原因，但是我國(guó)大陸尚未批準(zhǔn)HPV疫苗用于預(yù)防宮頸癌。即使批準(zhǔn)HPV疫苗上市，通過大規(guī)模接種HPV疫苗以有效減低宮頸癌的發(fā)病率，估計(jì)需要至少20年的時(shí)間;而在這段時(shí)間內(nèi)會(huì)有新的高危型HPV感染者和宮頸癌

2、新發(fā)患者。由于宮頸癌年輕化的趨勢(shì)以及我國(guó)女性生育年齡的推遲，越來越多的女性在未完成生育之前罹患宮頸癌，因此要求保留生育功能的宮頸癌患者數(shù)量逐漸增多。目前保留生育功能的治療方式主要是手術(shù)，而手術(shù)可引起宮頸管狹窄、孕期流產(chǎn)或早產(chǎn)等并發(fā)癥。另外，盡管大部分宮頸癌患者診斷時(shí)多為早期，但每年仍有大量患者被診斷為晚期宮頸癌，且部分對(duì)放化療不敏感。宮頸癌組織侵襲宮旁組織及出現(xiàn)宮旁浸潤(rùn)甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，是宮頸癌治療失敗的原因。因此，需要新的思路和方法治療宮

3、頸癌。
　　微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長(zhǎng)約20個(gè)核苷酸的非編碼RNA，可通過與靶基因的3'端非翻譯區(qū)結(jié)合，引起mRNA的降解或抑制蛋白翻譯。多種miRNA可調(diào)控人體的基因表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-146不僅與炎癥及免疫疾病密切相關(guān)，還與多種腫瘤如前列腺癌、肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。其中，miRNA-146a和miRNA-146b是高度同源的miRNA，屬于miRNA-146家族。MiR-

4、146b-5p是從miRNA-146b前體的5'端臂加工而來的。在多種惡性腫瘤中miR-146b-5p的表達(dá)異常下調(diào)，miR-146b-5p的過表達(dá)可抑制腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移，提示miR-146b-5p是一種抑癌基因。有研究表明，宮頸癌細(xì)胞系CaSki轉(zhuǎn)染miR-146a后，可以促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，提示miR-146a是一種癌基因。而目前miR-146b-5p在宮頸癌細(xì)胞中的作用尚不清楚。因此本課題旨在探討miRNA-146b-5p對(duì)宮頸

5、癌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期、侵襲能力、端粒酶活性及分泌細(xì)胞因子等生物學(xué)行為的影響，并初步探討其作用機(jī)制，為宮頸癌的靶向治療提供思路和實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行了論述。
　　第一部分:MiR-146b-5p對(duì)人宮頸癌細(xì)胞系Caski生物學(xué)行為的影響
　　目的:探討過表達(dá)miRNA-146b-5p對(duì)宮頸癌細(xì)胞系Caski增殖、細(xì)胞周期、侵襲、粘附、端粒酶活性及分泌細(xì)胞因子等生物學(xué)行為的影響。
　　方法:

6、(1)篩選并驗(yàn)證穩(wěn)定表達(dá)miRNA-146b-5p的細(xì)胞:應(yīng)用脂質(zhì)體將pGPU6/Neo-miR-146b-5p重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Caski細(xì)胞后用G418進(jìn)行篩選，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞miRNA-146b-5p的相對(duì)表達(dá)量。(2)MTS法檢測(cè)miR-146b-5p對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響。(3)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-146b-5p對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響。(4)細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-146b-5p對(duì)細(xì)胞粘附能力的影響。(

7、5)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-146b-5p對(duì)細(xì)胞周期的影響。(6)ELISA法檢測(cè)miR-146b-5p對(duì)細(xì)胞因子TGF-β1、MCP-1、TNF-α分泌的影響。(7)TRAP-PCR-ELISA法檢測(cè)miR-146b-5p對(duì)細(xì)胞端粒酶活性的影響。
　　結(jié)果:(1)篩選出穩(wěn)定表達(dá)miR-146b-5p的Caski細(xì)胞，miR-146b-5p轉(zhuǎn)染組Caski細(xì)胞miR-146b-5p的表達(dá)量顯著升高。(2)過表達(dá)miR-146b-5p

8、抑制Caski細(xì)胞的增殖活力。(3)過表達(dá)miR-146b-5p降低Caski細(xì)胞的侵襲能力。(4)過表達(dá)miR-146b-5p降低Caski細(xì)胞的粘附能力。(5)過表達(dá)miR-146b-5p增加Caski細(xì)胞周期中G0/G1細(xì)胞的比例。(6)過表達(dá)miR-146b-5p抑制細(xì)胞因子TGF-β1、MCP-1、TNF-α的分泌。(7)過表達(dá)miR-146b-5p降低Caski細(xì)胞端粒酶的活性。
　　結(jié)論:miR-146b-5p可以抑

9、制宮頸癌細(xì)胞Caski的增殖、侵襲和粘附能力，使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1，還抑制細(xì)胞因子TGF-β、MCP-1和TNF-α的分泌，并抑制端粒酶活性，從而抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　第二部分:MiR-146b-5p影響人宮頸癌細(xì)胞系Caski生物學(xué)行為的機(jī)制研究
　　目的:過表達(dá)miR-146b-5p對(duì)Caski細(xì)胞CXCR4、MMP-2、MMP-9、c-Myc、cyclin D1、p27、p53、HPV16 E6表達(dá)的影響，

10、對(duì)信號(hào)通路關(guān)鍵分子JNK、Akt磷酸化水平及NF-κB/STAT轉(zhuǎn)錄信號(hào)通路的影響，初步探索miR-146b-5p影響Caski細(xì)胞生物學(xué)行為的作用機(jī)制。
　　方法:(1)Real-time PCR和Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中CXCR4、MMP-2、MMP-9、c-Myc、cyclinD1、p27、p53及HPV16 E6在mRNA和蛋白的表達(dá)水平。(2)Western blot法檢測(cè)磷酸化JNK和Akt蛋白的表達(dá)。(3

11、)雙熒光素酶報(bào)告基因分析NF-κB、STAT3及STAT5的轉(zhuǎn)錄活性。
　　結(jié)果:(1)過表達(dá)miR-146b-5p下調(diào)Caski細(xì)胞CXCR4、MMP-2、MMP-9、c-Myc、cyclinD1和HPV16 E6的mRNA和蛋白的表達(dá)，上調(diào)p27和p53的mRNA和蛋白的表達(dá)。(2)過表達(dá)miR-146b-5p降低Caski細(xì)胞JNK、Akt磷酸化水平。(3)過表達(dá)miR-146b-5p降低Caski細(xì)胞NF-κB、STAT3