RNA干擾TFF3基因?qū)θ思谞钕偃轭^狀癌細(xì)胞增殖與侵襲的影響及機(jī)制研究.pdf

1、甲狀腺癌是頭頸部常見的腫瘤，也是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤。甲狀腺癌的發(fā)病率約占甲狀腺腫瘤的5％，占全身惡性腫瘤的1％左右。女性發(fā)病率是男性的3~4倍，是危害女性健康的十大癌種之一。甲狀腺癌死亡率約為6.8/10萬，是死亡率最低的五種癌癥之一。來源于濾泡上皮的分化型甲狀腺癌包括甲狀腺乳頭狀癌和濾泡癌,占甲狀腺癌的90%以上。甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid cancer，PTC)是最常見的病理類型，占甲狀腺癌的80％。

2、
　　當(dāng)前臨床指南推薦細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查(Fine needle aspiration,FNA）作為甲狀腺癌最有效的診斷方法。但受到多種因素的影響，如穿刺部位、采集方法和檢測技術(shù)的限制，導(dǎo)致約20%的甲狀腺結(jié)節(jié)誤診或漏診。因此，尋找準(zhǔn)確、敏感的診斷技術(shù)如基于分子生物學(xué)的診斷技術(shù)對甲狀腺癌的個(gè)體化醫(yī)療非常必要。甲狀腺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療通常包括手術(shù)治療、促甲狀腺激素抑制治療,甲狀腺殘?bào)w的放射性碘(RAI)治療。盡管甲狀腺癌的預(yù)后良好,仍有約

3、5%的患者會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移性疾病,該群體缺乏具體的、有效的治療方法。尋找有效的治療靶點(diǎn)和靶向藥物將助于進(jìn)一步提高該部分甲狀腺癌的治療效果。
　　三葉因子3(Trefoil factor3，TFF3)是三葉因子家族中發(fā)現(xiàn)最晚的小分子分泌性多肽，人TFF3由42個(gè)氨基酸殘基通過二硫鍵折疊而成三葉草結(jié)構(gòu)域。越來越多的證據(jù)表明,TFF3在癌癥的發(fā)生和進(jìn)展中有至關(guān)重要的作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TFF3mRNA和蛋白在不同的實(shí)體腫瘤過表達(dá)，包括乳腺癌、胃癌、

4、前列腺癌和結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌和肝細(xì)胞癌，并促進(jìn)癌細(xì)胞遷移、入侵、增殖、生存和血管生成。然而,Takano等首先發(fā)現(xiàn)甲狀腺濾泡癌中TFF3下調(diào)。隨后科學(xué)家以免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)乳頭狀和未分化癌TFF3蛋白質(zhì)低表達(dá)。但本課題組前期工作表明：PTC中TFF3高表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)將利用體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究 TFF3在PTC發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。
　　第一部分甲狀腺乳頭狀癌標(biāo)本TFF3的表達(dá)及臨床意義
　　目的：

5、檢測甲狀腺乳頭狀癌手術(shù)標(biāo)本中TFF3的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，探討TFF3在甲狀腺乳頭狀癌中的臨床意義。
　　方法：商用PTC組織芯片購于上海芯超生物技術(shù)有限公司，新鮮手術(shù)標(biāo)本源于2014年河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院甲狀腺癌手術(shù)標(biāo)本。取材前均經(jīng)患者知情同意，標(biāo)本經(jīng)兩名病理醫(yī)師明確診斷。對組織芯片進(jìn)行免疫組化染色；新鮮手術(shù)標(biāo)本部分用于原位雜交染色，部分用于RT-PCR法檢測內(nèi)源基因TFF3mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。
　　結(jié)果：<

6、br>　　1組織芯片中TFF3蛋白表達(dá)
　　31例乳頭狀癌乳頭狀結(jié)構(gòu)明顯，毛玻璃樣核、核型不規(guī)則、核溝明顯可見。陽性產(chǎn)物高表達(dá)于胞漿，癌旁濾泡上皮細(xì)胞為立方形，TFF3陰性或弱陽性。PTC組織TFF3陽性率和AOD值明顯高于癌旁組織。伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC病例TFF3全為陽性（15/15）,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性率68.75%（11/16），其表達(dá)水平（AOD值）在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)。臨床Ⅲ~Ⅳ期患者TF

7、F3的陽性率100%（20/20）明顯高于Ⅰ~Ⅱ期54.54%（6/11）患者(P<0.05)。
　　2 TFF3mRNA原位雜交
　　TFF3mRNA陽性信號為藍(lán)色顆粒，位于胞漿。癌組織陽性信號明顯高于癌旁，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　3 PTC中TFF3 RT-PCR結(jié)果
　　TFF3mRNA和β-actin的擴(kuò)增產(chǎn)物分別在100～200bp和200～500bp之間清晰擴(kuò)增帶。甲狀腺乳頭狀癌TF

8、F3/β-actin比值明顯高于癌旁組織（P<0.01）。
　　小結(jié)：
　　1 TFF3蛋白和mRNA在甲狀腺乳頭狀癌上皮細(xì)胞高表達(dá)。
　　2 PTC中TFF3蛋白高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)。
　　第二部分人TFF3 shRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及有效序列篩選
　　目的：構(gòu)建針對人TFF3的shRNA表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染自身表達(dá)TFF3的甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞，篩選出靶向人TFF3的最有效的siRNA序列。

9、
　　方法：
　　1根據(jù)GenBank中登錄的人TFF3mRNA序列，利用Invitrogen公司網(wǎng)站在線設(shè)計(jì)軟件分別在人TFF3基因mRNA的132?170、258和537bp處作為潛在靶位點(diǎn)，合成4條siRNA轉(zhuǎn)錄模板的發(fā)夾結(jié)構(gòu)（shRNA1~4）以及1條陰性對照（shRNAC）。按照 Sense+Loop+Antisense+終止信號的原則設(shè)計(jì)shRNA序列，并由廣州復(fù)能基因生物有限公司合成。體外退火后插入pLVX-s

10、hRNA-puro載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，酶切鑒定，并測序。
　　2 shRNAs質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時(shí)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效率。
　　3轉(zhuǎn)染shRNA-TFF3后各組細(xì)胞Quantitative Real-time PCR(qPCR)和western blot檢測TFF3mRNA和蛋白的沉默效率。
　　結(jié)果：
　　1人TFF3shRNA表達(dá)載體酶切鑒定
　　pLVX-ShRNA2-

11、puro-TFF3質(zhì)粒用XhoI做酶切鑒定。將鑒定的陽性質(zhì)粒送交公司測序，結(jié)果證明shRNA3,4插入序列與原設(shè)計(jì)序列完全一致, shRNA1，2發(fā)生了突變，后續(xù)實(shí)驗(yàn)舍去。
　　2各組細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后熒光表達(dá)結(jié)果
　　K1細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，倒置熒光顯微鏡觀察顯示，各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞中可見明顯的綠色熒光，表明重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞。其中shRNA3、shRNA4和shRNAC組熒光細(xì)胞數(shù)量分別占細(xì)胞總數(shù)的(79.83±2.3)

12、%?(71.7±3.0)%?(70.45±2.0)%，各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度基本一致；未轉(zhuǎn)染組K1細(xì)胞未見熒光?
　　3各組細(xì)胞TFF3mRNA表達(dá)量分析
　　轉(zhuǎn)染48h，與shRNAC組相比，shRNA3、shRNA4組TFF3mRNA水平顯著降低（均為P<0.01），qPCR顯示shRNA3和shRNA4組TFF3mRNA沉默效率分別為60.67%和57.33%。
　　4各組細(xì)胞TFF3蛋白表達(dá)量分析
　　West

13、ern blot結(jié)果顯示：shRNA3、shRNA4組TFF3蛋白的表達(dá)量明顯低于未轉(zhuǎn)染組和對照組（P<0.01）。
　　小結(jié)：
　　1本實(shí)驗(yàn)成功設(shè)計(jì)并構(gòu)建成功2組特異性靶向人TFF3基因的shRNA慢病毒載體。
　　2重組載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后的兩組K1細(xì)胞株，通過qPCR和western blot檢測，在轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平上顯著抑制了TFF3基因的表達(dá)，證實(shí)所構(gòu)建的靶向TFF3基因的重組shRNA慢病毒載體是成功、有效的。<

14、br>　　第三部分慢病毒介導(dǎo)shRNA靶向下調(diào)TFF3對人乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞生物特性的影響
　　目的：構(gòu)建shRNA靶向下調(diào)TFF3表達(dá)的乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株；檢測沉默TFF3基因?qū)PC-1細(xì)胞的體外生物學(xué)特性的影響及可能的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1慢病毒包裝293T細(xì)胞及病毒滴度測定。
　　2本研究中將采用慢病毒感染法構(gòu)建乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株；并以Quantitative Real-t

15、ime PCR和western blot檢測shRNA-TFF3-TPC-1細(xì)胞TFF3的沉默效率。
　　3檢測沉默TFF3對TPC-1細(xì)胞生物學(xué)特性的影響：克隆形成實(shí)驗(yàn)和CCK-8檢測TFF3基因?qū)PC-1細(xì)胞增殖能力、劃痕實(shí)驗(yàn)及transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測侵襲及粘附能力， Quantitative Real-time PCR PCR和免疫印跡檢測凋亡相關(guān)指標(biāo)bax和bcl-2的水平改變。<

16、br>　　結(jié)果：
　　1慢病毒包裝和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選
　　shRHAC和shRNA-TFF3慢病毒載體經(jīng)293T細(xì)胞包裝后可在熒光顯微鏡493nm下激發(fā)綠色熒光。慢病毒rLV-TFF3滴度為:5.0x107 TU/ml；rLV-shRNAC滴度為:1.0x109 TU/ml。經(jīng)過數(shù)日篩穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株shRNA-TFF3-TPC-1與空載體穩(wěn)轉(zhuǎn)株shRNAC-TPC-1細(xì)胞發(fā)出明亮的熒光，未轉(zhuǎn)染的TPC-1無綠色熒光。
　　

17、2 shRNA-TFF3-TPC-1和shRNAC-TPC-1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的鑒定
　　qPCR顯示：沉默組比對照組TFF3mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯降低（P<0.01）。Western blott結(jié)果顯示:與對照組相比shRNA-TFF3干擾組TFF3蛋白的表達(dá)顯著降低（P<0.01）。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示TFF3蛋白位于細(xì)胞質(zhì)，未轉(zhuǎn)染TPC-1和shRNAC組胞質(zhì)呈TFF3強(qiáng)陽性，shRNA-TFF3干擾組TFF3陽性信號明顯減弱（P<

18、0.01）。
　　3沉默TFF3基因TPC-1細(xì)胞增殖能力下降
　　克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染組TPC-1細(xì)胞和shRNAC組細(xì)胞形成克隆數(shù)目平為(28.7±3.6)個(gè)和（33.7±4.1）個(gè)，shRNA-TFF3干擾組形成克隆數(shù)目平均為（20.7±2.9）個(gè)，與TPC-1和shRNAC組相比克隆形成數(shù)量減少(P<0.05)。
　　CCK-8細(xì)胞增殖能力檢測顯示，siTFF3明顯抑制了TFF3細(xì)胞的增殖能力。與TPC

19、-1和shRNAC組相比，實(shí)驗(yàn)組shRNA-TFF3細(xì)胞株增殖能力明顯受到了抑制(P<0.01)。三組細(xì)胞在day2~day4進(jìn)入對數(shù)生長期，但沉默細(xì)胞株shRNA-TFF3在day2~day4的OD值明顯低于正常TPC-1和對照株shRNAC（P<0.01)。
　　4細(xì)胞遷移能力
　　通過細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：劃痕后12h和24h與0h相比，劃痕12h時(shí)三組劃痕寬度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，24hTPC-1、shRNAC和shRN

20、A-TFF3組劃痕寬度分別為26μm、17μm和75μm,shRNA-TFF3組細(xì)胞的遷移能力明顯低于shRNAC組及TPC-1組(P<0.01)，而shRNAC組及TPC-1組之間的無差異(P>0.05)。
　　Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示：shRNA-TFF3組上室細(xì)胞穿膜到達(dá)下室的細(xì)胞明顯少于shRNA組及TPC-1組，10%乙酸洗脫后，酶標(biāo)儀檢測三組吸光度值，沉默組吸光度值為0.8088±0.0012明顯低于shRNAC

21、組的1.1590±0.009122和TPC-1組的1.1950±0.02800，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， P<0.01。
　　5細(xì)胞侵襲能力
　　Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與shRNAC組及TPC-1組比較，shRNA-TFF3組上室細(xì)胞侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)明顯下降（P<0.01），shRNAC與TPC-1兩組間無顯著性差異（P>0.05）。10%乙酸洗脫后，酶標(biāo)儀檢測三組吸光度值，shRNA-TFF3沉默組明顯低于shRN

22、AC組及TPC-1組。
　　6細(xì)胞粘附能力
　　三組細(xì)胞培養(yǎng)2h后吸棄未粘附的細(xì)胞后，貼壁細(xì)胞經(jīng)CCK-8法檢測各組OD值，結(jié)果：三組細(xì)胞株總體粘附性有差異。其中，shRNA-TFF3粘附率為5.16%，顯著低于shRNA（P<0.05）。
　　7 TFF3基因沉默促進(jìn)TPC-1凋亡
　　(1) qPCR檢測bcl-2、bax基因轉(zhuǎn)錄水平
　　qPCR結(jié)果顯示：三組細(xì)胞均檢測到了bcl-2 mRNA、bax

23、 mRNA的表達(dá)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)shRNA-TFF3組促凋亡基因bax明顯高于對照組shRNAC,而抗凋亡基因bcl-2則低于對照組，均為P<0.01。
　　（2）BCL-2和 BAX蛋白水平變化
　　Western blot法檢測結(jié)果提示：shRNA-TFF3組與shRNAC組和TPC-1組相比，BCL-2蛋白明顯減弱，BAX蛋白明顯增強(qiáng)。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?）TUNEL原位凋亡

24、　　TUNEL染色陽性細(xì)胞細(xì)胞體積縮小，核固縮，染色質(zhì)凝聚，呈棕黃色或黃褐色顆粒，胞質(zhì)著色淺，呈現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)特征。shRNA-TFF3組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)多于shRNAC組及TPC-1。
　　小結(jié)：
　　1通過慢病毒侵染方法成功構(gòu)建了敲低表達(dá)TFF3的甲狀腺乳頭狀癌shRNA-TFF3-TPC-1細(xì)胞株。
　　2 TFF3基因沉默可以降低TPC-1細(xì)胞的體外增殖、遷移及侵襲能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　3 TF

25、F3基因沉默促進(jìn)bcl-2下調(diào)，bax上調(diào)。
　　第四部分shRNA-TFF3-TPC-1細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤作用
　　目的：裸鼠皮下接種人 TPC-1細(xì)胞株，制作人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞裸鼠模型,觀察TFF3基因沉默后對裸鼠體內(nèi)腫瘤組織生長能力的影響，在體驗(yàn)證shRNA沉默TFF3基因的生物學(xué)效應(yīng)。
　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組。
　　方法：
　　1實(shí)驗(yàn)分組
　　36只裸鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為三組，即正常對照組：裸

26、鼠右側(cè)腋窩中部外側(cè)皮下注射 TPC-1細(xì)胞?？蛰d體 shRNAC組：裸鼠皮下注射shRNAC- TPC-1細(xì)胞懸液?；虺聊?shRNA-TFF3組：裸鼠皮下注射shRNA-TFF3-TPC-1細(xì)胞懸液。
　　2細(xì)胞體外培養(yǎng)
　　三組TPC-1細(xì)胞在5％CO2、37℃正常條件下培養(yǎng)。制成1~2×105個(gè)細(xì)胞／ml的細(xì)胞懸液，待種。
　　3瘤細(xì)胞懸液接種及瘤體觀察
　　75%醫(yī)用酒精棉球消毒裸鼠右腋下皮膚，搖勻細(xì)胞

27、懸液，取0.2ml（細(xì)胞數(shù)5×105）緩慢注射于小鼠右腋部皮下。每日觀察小鼠狀態(tài)和移植瘤發(fā)生及生長情況。記錄三組移植瘤發(fā)生時(shí)間點(diǎn)，隔2日稱重測量腫瘤一次，并用游標(biāo)卡尺測量瘤體大小，繪制裸鼠移植瘤體積生長曲線。
　　4繼續(xù)飼養(yǎng)并連續(xù)觀察裸鼠情況，于最后一次腫瘤測量后，移出無菌層流室，每組各取雌雄各3只行小動(dòng)物活體成像然后安樂死處死動(dòng)物。取出腫瘤標(biāo)本，拍照；取癌組織塊，稱重后，切取2/3凍存于-80℃冰箱,其余部分制作蠟塊。
　

28、　5 HE染色及免疫組化染色
　　瘤體經(jīng)bouin’s液固定12h，逐級梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟，常規(guī)石蠟包埋。切片厚5?m、HE染色。
　　6腫瘤組織RNA提取及Quantitative Real-time PCR，檢測TFF3干擾表達(dá)TPC-1腫瘤中TFF3mRNA水平
　　結(jié)果：
　　1裸鼠生長狀態(tài)
　　三組細(xì)胞移植后TPC-1組和shRNAC組第7天成瘤，shRNA-TFF3組第10天成瘤。各

29、組裸鼠1～3周生長狀態(tài)良好，活動(dòng)、進(jìn)食均無異常，體重穩(wěn)步增長，第3周體重停止增長或增長緩慢。
　　2 shRNA-TFF3對TPC-1細(xì)胞移植瘤生長的影響
　　第7天TPC-1組和shRNAC組開始觸及瘤體,TFF3沉默組第10天開始成瘤,并快速生長。但TFF3沉默組裸鼠皮下移植瘤不僅成瘤滯后，而且生長速度明顯滯后于其余兩組。小動(dòng)物活體成像可見瘤體發(fā)出綠色熒光。shRNA-TFF3與shRNAC組相比瘤體小，且熒光強(qiáng)度弱。雄

30、性鼠瘤體大于雌性。
　　第28天,shRNA-TFF3組裸鼠腫瘤體積明顯小于shRNAC組和TPC-1組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果表明，敲低TFF3基因的表達(dá)能明顯抑制裸鼠移植瘤模型中TPC-1細(xì)胞的成瘤能力和腫瘤的生長能力（P<0.05)。
　　3. TFF3基因敲低對移植瘤重量的影響
　　在第28天觀察期結(jié)束后，將各組裸鼠處死，完整切取皮下腫瘤的瘤體。稱取三組腫瘤的重量。shRNA-TFF3組瘤體的

31、重量明顯低于未轉(zhuǎn)染組和空載體組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)。
　　4.瘤體HE染色及免疫組織化學(xué)染色
　　HE染色結(jié)果顯示瘤組織為癌細(xì)胞特點(diǎn)，可見病理性多核及核分裂相，細(xì)胞間可見少許結(jié)締組織。TFF3免疫組化染色可見免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞胞質(zhì)呈黃色或棕黃色，shRNAC和TPC-1組TFF3陽性信號強(qiáng)，shRNA-TFF3組幾乎陰性。各組瘤內(nèi)TFF3蛋白比較:與未轉(zhuǎn)染組和shRNAC組比較， shRNA-TFF3組蛋白表達(dá)

32、顯著降低，而未轉(zhuǎn)染組和shRNAC組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01)。
　　5移植瘤組織中TFF3mRNA水平
　　移植瘤qPCR結(jié)果顯示：沉默TFF3基因組TFF3mRNA水平低于未轉(zhuǎn)染組和shRNAC組（P<0.01)。穩(wěn)定敲低TFF3的TPC-1細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)穩(wěn)定，與體外沉默相近。
　　小結(jié)：
　　1甲狀腺乳頭狀癌TPC-1裸鼠移植模型成功建立。
　　2在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，敲低TFF3基因表達(dá)的TPC-1細(xì)胞能

33、顯著抑制腫瘤增長。乳頭狀癌 TPC-1細(xì)胞裸鼠模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果同體外細(xì)胞學(xué)功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
　　結(jié)論：
　　1甲狀腺乳頭狀癌高表達(dá)TFF3與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)。
　　2敲低內(nèi)源性TFF3表達(dá)，乳頭狀癌的TPC-1細(xì)胞生長受抑制、侵襲能力降低，體內(nèi)、外成瘤能力降低，可能通過促進(jìn) bcl-2下調(diào)，bax上調(diào)促進(jìn)TPC-1細(xì)胞凋亡影響細(xì)胞的生物學(xué)特性。
　　3 TFF3基因可以作為人類甲狀腺乳頭狀癌潛在的治療