99mTc-GSA對(duì)肝臟缺血再灌注損傷評(píng)估的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、引言：我國(guó)是肝炎尤其是乙肝高發(fā)國(guó)家，肝炎后肝硬化肝癌的發(fā)生率較高，肝癌的手術(shù)切除治療具有根治意義。在肝臟相關(guān)手術(shù)中，通常需要不同程度地阻斷肝血流，這就可能會(huì)發(fā)生肝臟缺血再灌注損傷（hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI）。HIRI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前研究認(rèn)為HIRI由多種因素共同作用導(dǎo)致大量的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞功能受損甚至死亡，是手術(shù)后肝功能衰竭的重要原因之一，故肝臟缺血再灌注后肝功能的準(zhǔn)確預(yù)估對(duì)臨床醫(yī)

2、生評(píng)估患者預(yù)后，制定治療方案，提高患者術(shù)后恢復(fù)及生存率有一定臨床價(jià)值。
　　肝功能的評(píng)估方法很多，其中基于肝臟去唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）顯像的肝功能評(píng)估方法可以動(dòng)態(tài)觀察肝細(xì)胞的攝取、代謝、排泄等功能過(guò)程，并可以計(jì)算功能肝細(xì)胞量，被認(rèn)為是目前正確評(píng)估肝功能很有前途的方法。目前較受關(guān)注的去唾液酸糖蛋白受體顯像劑是99mTc-GSA，其可與肝細(xì)胞膜表面的ASGPR特異性結(jié)合而

3、進(jìn)行肝臟顯像，ASGPR的數(shù)量和功能與肝細(xì)胞的功能呈正相關(guān)，通過(guò)檢測(cè)肝細(xì)胞 ASGPR的數(shù)量和活性，可評(píng)估肝的功能狀況。肝臟發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)，肝細(xì)胞發(fā)生不同程度的凋亡和壞死，肝細(xì)胞膜表面的ASGPR的數(shù)量和活性不同程度地下降，通過(guò)ASGPR顯像可了解肝功能狀況，評(píng)估HIRI造成的損傷，以便及時(shí)采取治療措施及評(píng)估預(yù)后。此外，99mTc-GSA肝臟SPECT/CT平面加斷層顯像還可評(píng)價(jià)區(qū)域肝功能，方法為在每個(gè)SPECT橫斷面上劃線模擬肝

4、切除，計(jì)算剩余或區(qū)域肝功能占整體肝功能的比例，該指標(biāo)可評(píng)估肝臟儲(chǔ)備功能，預(yù)測(cè)手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)臨床工作幫助很大，但計(jì)算操作較為復(fù)雜，為了適應(yīng)臨床需要,北京協(xié)和醫(yī)院建立了計(jì)算機(jī)程序,得到含有肝臟管道解剖結(jié)構(gòu)的三維立體功能影像，可用此程序模擬手術(shù)切除,計(jì)算出各部分肝臟的功能，使肝功能及區(qū)域肝功能的評(píng)估方法更具操作性，目前該程序正處于研究完善階段。
　　本研究通過(guò)構(gòu)建不同程度的兔肝臟缺血再灌注損傷模型，獲取肝臟不同損傷程度下的肝酶和病理結(jié)果，

5、而后進(jìn)行99mTc-GSA兔肝顯像實(shí)驗(yàn)，獲取顯像結(jié)果，分析顯像結(jié)果與肝酶和病理結(jié)果的相關(guān)性，探討99mTc-GSA對(duì)肝臟缺血再灌注損傷評(píng)估的可靠性，為臨床應(yīng)用99mTc-GSA預(yù)測(cè)肝臟缺血再灌注損傷以制定合理治療方案包括手術(shù)措施提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分、兔肝缺血再灌注損傷模型的建立
　　目的：采用新西蘭大白兔制作肝臟不同程度缺血再灌注損傷模型，探討肝不同缺血時(shí)間再灌注后的血清肝酶生化檢驗(yàn)指標(biāo)和組織病理的變化情況

6、，以及術(shù)后第3d、第7d上述指標(biāo)的變化情況，為肝缺血再灌注后99mTc-GSA肝顯像評(píng)估肝功能提供病理學(xué)基礎(chǔ)。
　　材料與方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組
　　將體重沒(méi)有明顯差異、雌雄不拘的健康成年新西蘭大白兔隨機(jī)分為A、B、C、D四組，每組8只，設(shè)置三個(gè)缺血時(shí)間段：30min、45min、60min，其中A組設(shè)為假手術(shù)組，B組為缺血30min組，C組為缺血45min組，D組為缺血60min組，假手術(shù)組僅解剖肝十二指腸韌

7、帶，不阻斷血供。
　　2.兔肝缺血再灌注模型的制作及取材
　　采用無(wú)損傷血管夾夾閉兔肝蒂，按照分組分別阻斷30min、45min、60min，取出血管夾，恢復(fù)肝血流灌注1h后，取肝組織、采血。而后，在術(shù)后第3d和第7d對(duì)該四組兔子分別進(jìn)行采血及超聲引導(dǎo)下肝臟穿刺取肝組織。
　　3.標(biāo)本處理
　　(1)血生化，取血后分離血清，測(cè)定ALT含量。
　　(2)組織經(jīng)福爾馬林固定后送往病理科進(jìn)行HE染色觀察。

8、　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)及積分以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)形式表示，統(tǒng)計(jì)處理采用一般線性模型重復(fù)測(cè)量方差分析，先進(jìn)行球形檢驗(yàn)分析各組重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)之間是否存在相關(guān)性，而后采用相應(yīng)的方差分析模型，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)以P<0.05認(rèn)為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.血清酶學(xué)
　　假手術(shù)組，ALT基本在正常范圍內(nèi)。缺血再灌注組B、C、D組間比較，術(shù)后同一天，D組ALT水平最

9、高，即血流阻斷1h組，其次是阻斷45min組，最后是30min組。缺血再灌注組組內(nèi)ALT水平均是阻斷血流再灌注1h后最高，術(shù)后第3d下降，至術(shù)后第7d基本恢復(fù)至正常水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.肝組織HE病理
　　HE病理結(jié)果顯示，假手術(shù)組及術(shù)前肝組織病理形態(tài)正常，胞質(zhì)均勻，核深染；缺血再灌注組肝組織細(xì)胞不同程度地被損害，以?shī)A閉60min組損害最重，其次是夾閉45min組，最后是夾閉30min組。缺血再灌注組組內(nèi)均是夾閉

10、血管再灌注1h后肝細(xì)胞損害最重，第3d損害程度有所減輕，至第7d進(jìn)一步恢復(fù)，B組基本恢復(fù)至正常水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：兔肝缺血再灌注模型制作簡(jiǎn)單、成功率高，制得的模型隨缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，肝酶升高，組織病理?yè)p害程度增加，缺血再灌注組再灌注1h損害最重，術(shù)后第3d、第7d逐漸恢復(fù)，這一梯度病理?yè)p害變化過(guò)程能很好地滿(mǎn)足下一步影像功能研究的需要。
　　第二部分、肝臟缺血再灌注損傷99mTc-GSA顯像的實(shí)驗(yàn)研究
　　

11、目的：結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝酶及病理指標(biāo)變化情況，探討99mTc-GSA肝顯像評(píng)估HIRI后肝功能的價(jià)值。
　　材料與方法：
　　1.動(dòng)物分組及HIRI模型的制作
　　實(shí)驗(yàn)兔分為假手術(shù)組和缺血再灌注組，再灌注組根據(jù)缺血時(shí)間再分為三組（缺血30min、45min、60min），并在術(shù)后第3和第7d繼續(xù)隨訪實(shí)驗(yàn)。
　　2.99mTc-GSA的制備及顯像參數(shù)
　　采用GSA試劑盒，按照文獻(xiàn)描述的方法制備99mTc-

12、GSA并檢測(cè)放化學(xué)純度，合格后用于顯像。對(duì)A、B、C、D四組術(shù)前、術(shù)后1h、術(shù)后3d及術(shù)后7d分別進(jìn)行顯像。處理顯像結(jié)果，獲得肝臟攝取率(LHL15)與血液清除指數(shù)(HH15)。
　　3.血生化及病理檢驗(yàn)
　　采血及病理檢查見(jiàn)第一部分。
　　4.結(jié)果處理
　　分析顯像結(jié)果，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理同第一部分，將顯像結(jié)果與血清肝酶及組織病理結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)分析相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1

13、.LHL15
　　缺血再灌注組肝臟攝取率最低的時(shí)間點(diǎn)均是T2，即阻斷血流再灌注1h后最低，其次是術(shù)后3d，術(shù)后7d有所恢復(fù)，假手術(shù)組攝取率基本處正常水平；組間比較，同一時(shí)間，D組攝取率最低，即血流阻斷1h組，其次是阻斷45min組，再次是30min組，假手術(shù)組基本處于正常水平。
　　2.HH15
　　組間比較，同一時(shí)間，D組HH15最大，即血流阻斷1h組，其次是阻斷45min組，再次是30min組，假手術(shù)組基本處于正常

14、水平；缺血再灌注組顯像劑血液清除指數(shù)值最大的時(shí)間點(diǎn)均是T2，即阻斷血流再灌注1h后值最大，其次是術(shù)后3d，術(shù)后7d減小，假手術(shù)組HH15基本處正常水平。
　　3.顯像結(jié)果與病理及肝酶的相關(guān)性分析
　　LHL15、HH15、ALT、HE組織病理評(píng)分這四個(gè)變量的Pearson相關(guān)檢驗(yàn)結(jié)果示：LHL15與 HH15呈高度負(fù)相關(guān)，r=-0.967，p<0.01； LHL15與HE呈高度負(fù)相關(guān)，r=-0.957，p<0.01；LHL1