三種重要傳染病病原體重組酶擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)的建立與應(yīng)用.pdf

1、傳染病自古以來便威脅著人類生命健康安全，是造成人類死亡的重要?dú)⑹?，全球每年死亡人?shù)中有1/4是死于傳染病，加之新發(fā)突發(fā)傳染病疫情頻繁發(fā)生帶來的全球性災(zāi)難和恐慌，使得臨床診斷和治療面臨著前所未有的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的傳染病診斷方法主要包括病原學(xué)檢測(cè)、免疫學(xué)檢測(cè)以及分子生物學(xué)檢測(cè)。但基于病原學(xué)的分離培養(yǎng)法具有耗時(shí)久、需要具有專業(yè)操作技能的工作人員投入大量的精力、敏感性低、陽性率低、以及早期診斷易漏診等限制與不足，并不適用于傳染病監(jiān)測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，尤其

2、在大規(guī)模疫情爆發(fā)時(shí)。免疫學(xué)檢測(cè)主要是利用抗原抗體特異性的結(jié)合反應(yīng)，常見的有ELISA、膠體金免疫層析等。但由于發(fā)病期間抗原抗體產(chǎn)生的量、出現(xiàn)時(shí)間的早晚以及交叉反應(yīng)等因素，使這種方法容易出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果。分子生物學(xué)技術(shù)中的普通PCR，以及Real-Time PCR等變溫核酸擴(kuò)增技術(shù)都不可避免的要經(jīng)歷變性、退火、延伸等熱循環(huán)步驟，需要具備精密昂貴的PCR擴(kuò)增儀器才能實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增，限制了其在基層單位以及現(xiàn)場(chǎng)簡(jiǎn)陋條件的應(yīng)用，加之?dāng)U增時(shí)間長

3、，成本又高，所以并不適合傳染病的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和床旁診斷。因此，研究和發(fā)展一種快速高效、操作簡(jiǎn)便、靈敏可靠的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)傳染病的診斷、治療和疫情的控制具有重要意義。
　　重組酶聚合酶核酸擴(kuò)增（RPA，Recombinase Polymerase Amplification）是一種基于重組酶聚合酶反應(yīng)原理核酸恒溫?cái)U(kuò)增新技術(shù)，利用該技術(shù)在25-42℃恒溫條件下，20min內(nèi)即可完成核酸擴(kuò)增，敏感性高，特異性強(qiáng)，且操作簡(jiǎn)便。本研究以布魯氏菌、

4、腺病毒和埃博拉病毒分別作為細(xì)菌、DNA病毒和RNA病毒的代表，建立這3種病原體的RPA檢測(cè)方法，使臨床和現(xiàn)場(chǎng)疫情防控中傳染病病原體的快速檢測(cè)成為可能。
　　一、布魯氏菌RPA檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用
　　本研究以布魯氏菌為研究對(duì)象，建立布魯氏菌RPA的檢測(cè)方法并利用臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)效果評(píng)價(jià)。具體步驟包括：（1）查閱文獻(xiàn)，確定靶標(biāo)基因；（2）根據(jù)RPA引物及探針設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)并合成8條正反向候選引物及探針；（3）篩選最佳引物組合進(jìn)

5、而建立RPA最佳反應(yīng)體系；（4）構(gòu)建陽性對(duì)照質(zhì)粒，對(duì)RPA進(jìn)行敏感性評(píng)價(jià)；（5）利用其它病原菌進(jìn)行特異性評(píng)價(jià)；(6)臨床樣本的檢測(cè)應(yīng)用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示布魯氏菌RPA檢測(cè)方法的最佳引物組合為Bru-RPA-F1和Bru-RPA-R3，達(dá)到閾值所需時(shí)間僅為4min，而熒光信號(hào)強(qiáng)度則達(dá)到了666.5Int[mv]，靈敏度高達(dá)為3copies/μl，特異性好。臨床樣本檢測(cè)中，5名經(jīng)RT-PCR檢測(cè)為陽性的病人血樣經(jīng)RPA檢測(cè)也為陽性，

6、閾時(shí)間分別7.8min、10min、13.1min、13.8min、18.8min。為了進(jìn)一步驗(yàn)證布魯氏菌RPA檢測(cè)方法的正確性，我們對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與靶標(biāo)序列一致，表明擴(kuò)增是序列是正確的。
　　二、腺病毒RPA檢測(cè)方法的建立
　　通過系統(tǒng)比較腺病毒基因組序列，篩選出高度保守的區(qū)域作為靶標(biāo)區(qū)域。根據(jù)保守序列的區(qū)域，設(shè)計(jì)了探針和引物，篩選最佳引物組合，建立方法，并對(duì)方法的敏感性和特異性進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果顯示，腺病毒RP

7、A檢測(cè)方法的最佳引物為Adv-RPA-F1和Adv-RPA-R4，該組引物達(dá)到閾值所需時(shí)間不到2min，靈敏度可以達(dá)到至少10個(gè)拷貝數(shù)每微升，特異性測(cè)試顯示，腺病毒RPA檢測(cè)方法能夠特異檢測(cè)到腺病毒的核酸，而其它病原的核酸沒有擴(kuò)增，顯示了較好的特異性。
　　三、埃博拉RPA檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用
　　根據(jù)2014年爆發(fā)疫情病毒基因組序列，針對(duì)N蛋白的基因序列設(shè)計(jì)引物探針，人工合成陽性對(duì)照序列并構(gòu)建假病毒載體，獲得陽性對(duì)照。篩選

8、最佳的引物組合，建立RPA檢測(cè)方法。建立簡(jiǎn)便的樣本快速處理方法，篩選適合RPA的樣本處理方法。結(jié)果顯示，埃博拉病毒RPA檢測(cè)方法的最佳引物為EBOV-RPA-F2和EBOV-RPA-R2，其靈敏度可以達(dá)到10個(gè)拷貝數(shù)，特異性好。在應(yīng)用評(píng)價(jià)中，對(duì)375份樣本進(jìn)行了評(píng)估分析，與RT-PCR對(duì)比，EBOV-RPA總體敏感性97％(95%CI:95.5–99.3)；總體特異性97%,(95%CI:93.9–100)；陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、陽性

9、似然比和陰性似然比分別為99%,94%,33.8,和0.03。在RT-PCR檢測(cè)為陽性的樣本（264名）中，對(duì)于Ct值小于34的樣本（255名）來說，其敏感性達(dá)到了100%。而對(duì)于那些檢測(cè)不一致的樣本，即RT-PCR檢測(cè)為陽性EBOV-RPA檢測(cè)卻為陰性的樣本，其 Ct值都很高。本研究還利用盲樣對(duì)EBOV-RPA進(jìn)行了EQA評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示其百分百正確。
　　綜上所述，本研究以布魯氏菌、腺病毒和埃博拉病毒重要傳染病病原體為研究對(duì)象，