四種自然疫源病原體可視化LAMP檢測技術(shù)建立與現(xiàn)場檢測箱組研制.pdf

1、高致病性豬鏈球菌病、炭疽病、高致病性禽流感、腎綜合征出血熱等自然疫源性疾病病死率高，又多通過野外環(huán)境中的媒介節(jié)肢動物、嚙齒動物、禽類傳播，嚴(yán)重威脅畜牧業(yè)生產(chǎn)、經(jīng)營甚至接觸的人群，以及野外訓(xùn)練官兵、作戰(zhàn)部隊的健康和生命安全。這些重要的自然疫源性疾病，平時亦可引發(fā)突發(fā)公共衛(wèi)生事件，引起普遍恐慌。另外值得注意的是，部分國家或地區(qū)已經(jīng)將自然疫源性疾病病原列入生物戰(zhàn)計劃當(dāng)中，作為生物戰(zhàn)/生物恐怖病原。上述疫病的早期臨床表現(xiàn)常常難以鑒別，最終病因確

2、認(rèn)有賴病原檢測，盡快篩查并明確診斷對控制疫情至關(guān)重要。
　　易于現(xiàn)場使用的膠體金免疫層析技術(shù)，存在難以克服的敏感性問題;核酸檢測方法目前主要為PCR或?qū)崟r熒光定量PCR，但昂貴精密的PCR儀難以在現(xiàn)場展開，成為其被廣泛使用的障礙。病原應(yīng)急檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢是能早期在疫源地快速檢測出病原特異性的致病基因和毒力基因，敏感性好;無需對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳或雜交后的復(fù)雜清洗步驟，操作簡單，易于規(guī)范;成本適宜或低廉。環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增(LAMP)及

3、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增(RT-LAMP)技術(shù)恰恰具有上述特點(diǎn)，在應(yīng)用于自然疫源性疾病病原檢測方面有著明顯的優(yōu)勢。
　　本研究針對多種重要和新發(fā)自然疫源性疾病病原體，研究快速篩查檢測的LAMP/RT-LAMP方法及配套便攜裝備。綜合應(yīng)用可視化LAMP/RT-LAMP全封閉檢測技術(shù)，研究對自然疫源性疾病病原進(jìn)行現(xiàn)場快速篩查的方法和檢測試劑（引物、反應(yīng)體系），可檢測高致病性豬鏈球菌2型、炭疽桿菌（可鑒定強(qiáng)毒株、弱毒株）、H7N9禽流感病毒

4、、腎綜合征出血熱病毒（可區(qū)分漢城型、漢灘型）等自然疫源性疾病病原，具有快速、敏感的特點(diǎn)。在建立病原LAMP檢測方法的同時，還設(shè)計制作一套便攜式恒溫檢測箱組（基于小型恒溫金屬浴的可視化LAMP檢測箱），采用車載逆變電源和鋰電池供電，可立足自身保障，在疫情現(xiàn)場或野外進(jìn)行篩查檢測。
　　具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　一、Cps2j-LAMP和Salk-LAMP檢測方法的建立及其在快速鑒定高致病性S.suis2中的應(yīng)用
　　豬

5、鏈球菌2型是豬鏈球菌病最主要的病原，也是一些發(fā)展中國家急性細(xì)菌性腦膜炎的主要病原，其中引發(fā)鏈球菌中毒性休克綜合癥（死亡率達(dá)80％以上）的高致病性強(qiáng)毒株含有獨(dú)特的“89K毒力島”，可作為判定豬鏈球菌2型毒力強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。本研究建立了快速檢測高致病性豬鏈球菌2型及其89K毒力島的LAMP檢測方法，最快只需擴(kuò)增18 min即可出檢測結(jié)果，靈敏度可達(dá)7.16拷貝每反應(yīng)。還應(yīng)用完全相同的一套核酸梯度稀釋模板（豬鏈球菌05ZYH33株），針對建立

6、的同一細(xì)菌不同靶基因的兩套LAMP反應(yīng)體系，對目前LAMP技術(shù)的五種常見終點(diǎn)可視化檢測方法進(jìn)行了測試比較。
　　二、炭疽桿菌雙重可視化LAMP檢測方法的建立及其在強(qiáng)弱毒株判定中的應(yīng)用
　　選擇炭疽桿菌編碼保護(hù)性抗原的PA基因（在pX01毒力質(zhì)粒上），以及與莢膜合成相關(guān)的capA基因（在pX02毒力質(zhì)粒上）作為檢測靶基因，建立了一種能實現(xiàn)不開蓋，無需濁度儀即能實現(xiàn)肉眼可視化檢測，又同時能區(qū)分強(qiáng)毒株、弱毒株或無毒株（即可初步判定

7、毒力）的雙重LAMP檢測方法，檢出限均為50拷貝每反應(yīng)。除雙重LAMP法檢測炭疽桿菌外，本研究還制備一種用于炭疽桿菌核酸檢測的通用陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，可兼容目前的絕大部分炭疽桿菌核酸檢測方法，具有全面性、普遍適用性和可比性;組裝了LAMP法檢測炭疽桿菌的凍干粉試劑盒，可常溫儲存，有可能應(yīng)用于應(yīng)對突發(fā)傳染病疫情和現(xiàn)場反生物恐怖襲擊預(yù)警等。
　　三、高致病性H7N9禽流感RT-LAMP檢測方法建立與臨床應(yīng)用
　　建立了快速檢測H7N

8、9禽流感病毒的RT-LAMP檢測方法，只需12 min至23 min內(nèi)即可出擴(kuò)增檢測結(jié)果。其中檢測血凝素(HA)基因的RT-LAMP(H7-RT-LAMP)的敏感性與WHO推薦的實時熒光定量PCR(H7-rRT-PCR)的敏感性相同;而檢測神經(jīng)氨酸酶(NA)基因的N9-RT-LAMP比WHO推薦的N9-rRT-PCR方法靈敏100倍。本研究應(yīng)用135例臨床標(biāo)本（包括患者和禽類標(biāo)本）對建立的H7N9禽流感病毒的RT-LAMP檢測方法進(jìn)行了

9、測試比較:對已確診病例的檢測均為陽性;對疫情爆發(fā)期間某活禽市場禽類標(biāo)本的檢測，陽性率為20.87％(24/115)。在H7基因核酸檢測陽性的樣品中，N9-RT-LAMP對N9基因的檢出率顯著高于對應(yīng)的N9-rRT-PCR。這種對于N9基因片段的高辨別力，可能有助于更好的將H7N9病毒從H7N1、H7N2、H7N3、H7N7等其它H7亞型病毒中區(qū)分出來。
　　四、腎綜合征出血熱病毒RT-LAMP檢測方法的建立與臨床測試
　　腎

10、綜合征出血熱病例集中在山區(qū)和丘陵地帶，中國是全球疫情最為嚴(yán)重的國家。本研究建立了腎綜合征出血熱病毒的RT-LAMP檢測方法，并能區(qū)分目前在中國的主要流行株漢灘型病毒、漢城型病毒，具有操作簡便、快速、特異、敏感的特點(diǎn)，結(jié)合終點(diǎn)檢測的羥基萘酚藍(lán)(HNB)法，可以直接通過顏色變化肉眼判斷結(jié)果，實驗過程無需開蓋，減少污染風(fēng)險，有可能作為目前腎綜合征出血熱病毒血清學(xué)檢測方法的有益補(bǔ)充。
　　五、病原核酸恒溫現(xiàn)場檢測箱的研制
　　為解決

11、野外、現(xiàn)場檢測的瓶頸問題（無市電、無冷鏈、無工作臺面），組裝了基于恒溫擴(kuò)增和凍干技術(shù)，包含能常溫儲備的凍干粉可視化檢測試劑、小型儀器及必需耗材（加樣器、吸頭、常溫下核酸抽提的磁珠試劑等），能夠在現(xiàn)場完成LAMP（或病毒類的逆轉(zhuǎn)錄LAMP）恒溫擴(kuò)增檢測全過程的便攜式試劑箱組。設(shè)計為除市電外，還可使用鋰電池，或車載逆變電源模塊供電（通用于普通汽車），便于野外機(jī)動使用。
　　研究結(jié)果表明，對于高致病性豬鏈球菌病、炭疽病、H7N9禽流感、