PI3K-Akt信號介導(dǎo)Nε-羧甲基賴氨酸參與動脈粥樣硬化的機制研究.pdf

1、背景和目的：
　　近年來我國糖尿病發(fā)病率呈現(xiàn)持續(xù)高速增長，現(xiàn)已成為全球范圍內(nèi)糖尿病患者人數(shù)最多的國家。眾所周知，糖尿病會引發(fā)許多并發(fā)癥，其中尤以動脈粥樣硬化（AS）因其高致死率及高致殘率受到全球醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注。血管內(nèi)皮下細胞吞噬氧化低密度脂蛋白（oxLDL）形成泡沫細胞是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中最為重要的起始階段。關(guān)于泡沫細胞的最終宿命目前多認為在纖維帽下發(fā)生凋亡或者壞死形成脂質(zhì)壞死核心。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對動脈粥樣硬化疾病研究不斷深

2、入，人們逐步認識單核巨噬細胞向內(nèi)皮下內(nèi)遷和泡沫細胞的外遷在正常生理情況下呈現(xiàn)動態(tài)平衡。但是在病理情況下這個過程就會被打破導(dǎo)致內(nèi)皮下內(nèi)遷的細胞增多，同時外遷細胞卻越來越少，形成細胞的大量聚集，促使動脈粥樣斑塊形成，加速血管壁惡性重構(gòu)。
　　本研究主要借助 ApoE基因敲除小鼠及 RAW264.7單核-巨噬細胞建立糖尿病動脈粥樣硬化模型及泡沫細胞模型。觀察高脂飲食、Nε-羧甲基賴氨酸（CML）及體內(nèi)注射PI3K特異性激動劑740Y-P

3、后對小鼠動脈粥樣硬化斑塊影響及相關(guān)蛋白表達情況；觀察CML對RAW264.7源性泡沫細胞遷移、細胞活性及相關(guān)蛋白表達的影響及PI3K/Akt信號通路在細胞遷移及細胞活性中的作用。
　　方法：
　　本實驗主要由體內(nèi)試驗和體外實驗兩個部分構(gòu)成。體內(nèi)實驗我們采用ApoE基因敲除小鼠為研究對象，通過腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素（S TZ,40 mg/k g/day）制備小鼠的糖尿病模型。將血糖濃度大于300mg/dL的ApoE基因敲除小鼠分

4、成四組如下：對照組（普通飼料）、模型組（高脂飼料）、CML組（模型組＋注射CML:10mg/kg/day）、740Y-P組（CML組＋注射740Y-P:5μmol/kg/day）；觀察各實驗組小鼠主動脈動脈粥樣硬化斑塊形成情況。采用蘇木素-伊紅染色（HE染色）分析ApoE基因敲除小鼠主動脈斑塊組織形態(tài)學(xué)變化，油紅O染色觀察脂滴在小鼠斑塊內(nèi)的分布情況，免疫熒光、免疫組化、實時熒光定量PCR檢測斑塊內(nèi)CD68（巨噬細胞源性細胞重要標記物）、

5、CML表達，同時免疫熒光觀察p-Akt在小鼠斑塊中的表達情況及其具體位置，通過收集小鼠血清測量不同干預(yù)條件下對小鼠血脂成分變化。
　　在細胞實驗中采用RAW264.7細胞為研究對象，通過在培養(yǎng)基中添加oxLDL與 RAW264.7細胞共孵育制備泡沫細胞模型。油紅 O染色定性檢測泡沫細胞模型構(gòu)建，酶法測定細胞內(nèi)膽固醇含量變化定量檢測泡沫細胞模型構(gòu)建。將構(gòu)建好的泡沫細胞首先給予不同濃度CML（0μmo l/L、1μmo l/L、10μ

6、mo l/L、100μmo l/L）干預(yù)，MTT、流式細胞儀檢測不同濃度CML對RAW264.7源性泡沫細胞活性的影響；transwell小室檢測不同濃度CML對RAW264.7源性泡沫細胞遷移的影響，以期為下一步實驗挑選較為合適的干預(yù)條件。接下來實驗分組如下：對照組， oxLDL組（對照組＋oxLDL：40μg/ml）,CML組（oxLDL組＋CML：10μmol/L），740Y-P組（CML組＋740Y-P：10μmol/L）；tr

7、answell小室檢測不同實驗組RAW264.7源性泡沫細胞的遷移，western blot、細胞免疫熒光檢測各實驗組細胞內(nèi)相關(guān)蛋白改變，鬼筆環(huán)肽標記的F-actin檢測不同實驗組中RAW264.7源性泡沫細胞內(nèi)纖維形肌動蛋白的改變。
　　結(jié)果：
　　（1）模型組小鼠主動脈 HE染色有典型的動脈粥樣斑塊形成，可見明顯的纖維帽。CML組的動脈粥樣斑塊更加明顯，可見明顯的纖維帽形成，出現(xiàn)脂質(zhì)壞死核心，甚至出現(xiàn)纖維斑塊破裂。740

8、Y-P組小鼠主動脈斑塊面積較CML組明顯減少，但是較模型組斑塊稍增大，可見典型斑塊形成，部分纖維帽局部有破裂發(fā)生。對照組小鼠主動脈有早期斑塊形成，且血管壁相對比較完整，血管內(nèi)皮偶有輕微破壞，未見明顯纖維帽及壞死核心。
　?。?）免疫熒光顯示模型組斑塊面積較對照組增大，CML、CD68熒光亮度較對照組增強，且在動脈粥樣硬化斑塊部位明顯增多；CML組較740Y-P組和模型組斑塊面積更大，熒光強度更強（特別是斑塊部位）；740 Y-P組

9、斑塊面積較CML組明顯減小，熒光減弱；但是較模型組斑塊面積稍增大，熒光強度較模型組增強，同時CML可以下調(diào)p-Akt在斑塊中熒光表達，740 Y-P可以部分逆轉(zhuǎn)此過程，p-Akt總體熒光變化趨勢和 CML、CD68熒光趨勢呈現(xiàn)反相關(guān)。與對照組和模型組相比免疫組化及RT-PCR證實CML、C D68在CML組和740 Y-P組小鼠斑塊內(nèi)的表達呈現(xiàn)增多，其結(jié)果與免疫熒光強度結(jié)果類似（P<0.05）。
　?。?）oxLDL可誘導(dǎo)RAW2

10、64.7細胞形成RAW264.7源性泡沫細胞。不同濃度的CML干預(yù)都可以對RAW264.7源性泡沫細胞細胞活性及增殖產(chǎn)生影響。且隨著CML濃度的不斷增加，對細胞活性的抑制作用增強。
　　（4）CML可以抑制 RAW264.7源性泡沫細胞遷移，這個過程可以部分被740Y-P所逆轉(zhuǎn)。
　?。?）CML可以明顯增加RAW264.7源性泡沫細胞cleaved caspase-3蛋白表達，減低p-Akt蛋白表達，其結(jié)果可以部分被740

11、Y-P逆轉(zhuǎn)。
　?。?）CML可以降低 RAW264.7源性泡沫細胞內(nèi)F-actin熒光強度，影響細胞遷移，740Y-P可以部分增強F-actin熒光強度。
　　結(jié)論：
　?。?）CML可以促進Apo E基因敲除小鼠主動脈粥樣斑塊形成，增加巨噬細胞源性細胞及脂滴在斑塊內(nèi)蓄積。
　　（2）CML可以抑制 RAW264.7源性泡沫細胞遷移，這個過程可以部分被740Y-P所逆轉(zhuǎn)。
　　（3）CML促進動脈粥樣形成