金屬納米粒和膜聯(lián)蛋白A2受體在新生血管形成中的作用研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 金納米棒抑制新生血管形成的作用研究
　　目的：
　　研究金納米棒(Gold nanorods，GNRs)被細(xì)胞內(nèi)吞的途徑及其特異性抑制體外血管形成的作用及機(jī)制。
　　方法：
　　利用種子生長法合成GNRs并進(jìn)行聚乙二醇修飾（PEGYlated GNRs），并檢測合成的GNRs各項表征及在細(xì)胞培養(yǎng)基中表征的變化。我們進(jìn)一步利用化合物抑制劑和小干擾RNA研究GNR

2、s入胞的機(jī)制;采用細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移及管樣形成等方法研究GNRs對HREC功能的影響;.利用激光共聚焦檢測GNRs對HREC細(xì)胞骨架的影響;利用流式細(xì)胞儀檢測GNRs對HREC細(xì)胞周期的影響;最后利用Western blot檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　我們利用改進(jìn)的種子生長法合成列縱橫比大、純度高的GNRs，并成功修飾巰基聚乙二醇，該納米棒可以吸附細(xì)胞培養(yǎng)基及細(xì)胞分泌的蛋白形成蛋白暈，該蛋白暈進(jìn)一步改變了G

3、NRs的特性。GNRs入胞的機(jī)制是時間依賴的，不同時間機(jī)制不同。同時，我們發(fā)現(xiàn)該GNRs可以特異性抑制HREC的增殖、遷移、管樣形成及引起HREC細(xì)胞骨架的變化。其抗血管功能是通過抑制HREC細(xì)胞周期于G1期，并抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　GNRs通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯特異性抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖而對其它細(xì)胞無影響，使其在治療新生血管疾病上展現(xiàn)很大潛力。
　　第二部分 氧化亞銅納米粒抑制新生血管形成的作用研究

4、
　　目的：
　　探索氧化亞銅納米粒（Cuprous oxide nanoparticles，CO-NPs）對新生血管生成的影響及其可能機(jī)制。
　　方法：
　　利用液相氧化還原法合成CO-NPs并利用EdU試劑盒檢測CO-NPs對臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）增殖的影響;用倒置相差顯微鏡觀察CO-NPs處理后HUVEC形態(tài)的變化;利用T

5、ranswell實驗檢測CO-NPs對HUVEC遷移能力的影響;利用管樣形成實驗檢測CO-NPs對HUVEC管樣形成能力的影響;利用體外注射Matrigel膠實驗檢測CO-NPs對體外新生血管形成能力的影響;流式細(xì)胞儀檢測CO-NPs對細(xì)胞周期和凋亡的影響;利用Western blot和RT-PCR檢測CO-NPs抑制體外新生血管形成的機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　合成的CO-NPs具有丁達(dá)爾現(xiàn)象、粒徑約60nm并且?guī)в姓姾?C

6、O-NPs處理后死亡細(xì)胞顯微鏡下呈現(xiàn)透亮變圓的形態(tài);CO-NPs可以明顯抑制HUVEC的增殖、遷移及體內(nèi)外血管生成。CO-NPs可以明顯抑制細(xì)胞周期于S期并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。CO-NPs抑制新生血管的機(jī)制是通過下調(diào)血管生成因子受體2(Vascular endothelialgrowth factor receptor2，VEGFR2)的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　CO-NPs通過特異性抑制VEGFR2表達(dá)發(fā)揮其抗血管作用，可能成為靶

7、向治療新生血管性疾病的新物質(zhì)。
　　第三部分 干擾膜聯(lián)蛋白A2受體抑制新生血管形成的作用研究
　　目的：
　　探索干擾AXⅡR表達(dá)后對體外新生血管形成的影響及其可能機(jī)制。
　　方法：
　　Western blot和RT-PCR檢測脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染AXⅡR后的干擾效率。利用EdU實驗檢測干擾AXⅡR對HUVEC增殖的影響;利用Transwell實驗檢測干擾AXⅡR對HUVEC遷移能力的影響;通過細(xì)胞粘附實驗檢測干擾

8、AXⅡR后HUVEC粘附能力的改變;利用管樣形成實驗檢測干擾AXⅡR對HUVEC管樣形成能力的影響;體外注射Matrigel膠實驗檢測干擾AXⅡR對體外新生血管形成能力的影響;流式細(xì)胞儀檢測干擾AXⅡR后對細(xì)胞周期和凋亡的影響;最后用Western blot和RT-PCR檢測干擾AXⅡR后抑制體外新生血管形成的機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　AXⅡR在HUVEC中表達(dá)，并且siAXⅡ R可以明顯抑制AXⅡR在mRNA和蛋白水平的表達(dá)

9、;siAXⅡR可以明顯抑制HUVEC的增殖、遷移、粘附及體內(nèi)外血管生成。siAXⅡR可以明顯抑制細(xì)胞周期于S期而對細(xì)胞凋亡無明顯影響;最后我們證明siAXⅡR通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases）2和9的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮抑制新生血管的作用
　　結(jié)論：
　　本研究表明AXⅡR血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、黏附等方面發(fā)揮重要作用，可能成為治療新生血管的新靶點。
　　第四部分 氧化亞銅納米粒抑制葡

10、萄膜黑色素瘤的作用研究
　　目的：
　　探索CO-NPs對脈絡(luò)膜黑色素瘤(Uveal melanoma，UM)的影響及可能的機(jī)制。
　　方法：
　　利用Western blot和蛋白質(zhì)譜分析研究了CO-NPs與細(xì)胞共孵育后表征的變化;利用CCK-8實驗檢測了CO-NPs對UM細(xì)胞系(C918)、人腎癌細(xì)胞系(A498)、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(Retinal pigment epithelium cell，RPE)和

11、人胚腎細(xì)胞(293T)增殖的影響;利用Transwell小室檢測了C918細(xì)胞的遷移和侵襲能力;利用激光共聚焦檢測了C918形態(tài)的變化;利用化學(xué)抑制劑探索了C918內(nèi)吞CO-NPs的途徑;.利用投射電鏡探索了CO-NPs在C918細(xì)胞內(nèi)的定位;利用流式細(xì)胞儀檢測CO-NPs對線粒體膜電位的影響;利用TUNEL實驗檢測CO-NPs對細(xì)胞凋亡的影響;利用激光共聚焦檢測CO-NPs對細(xì)胞自噬的影響;最后利用Western blot檢測CO-N

12、Ps對細(xì)胞自噬和凋亡的影響
　　結(jié)果：
　　CO-NPs與細(xì)胞孵育后可以吸附血清中的蛋白，使得CO-NPs電位由正變負(fù);CO-NPs可以特異性的抑制腫瘤細(xì)胞增殖而對正常細(xì)胞無影響;CO-NPs可以濃度依賴的抑制C918細(xì)胞的遷移和侵襲并改變細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu);CO-NPs主要通過脂筏結(jié)構(gòu)進(jìn)入細(xì)胞，并定位于自噬體和線粒體;CO-NPs可以導(dǎo)致線粒體功能異常并誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧;CO-NPs可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白活化;CO-N