脂肪細胞在腹膜血管新生和內(nèi)皮功能紊亂中的作用研究.pdf

1、背景：長期腹膜透析（腹透）患者有發(fā)生腹膜超濾衰竭導(dǎo)致患者退出腹透和發(fā)生心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)導(dǎo)致患者死亡的風(fēng)險。內(nèi)皮細胞與腹膜血管新生從而導(dǎo)致腹膜超濾衰竭及CVD的發(fā)生密切相關(guān)。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞功能、介導(dǎo)血管新生的重要細胞因子。內(nèi)皮細胞功能紊亂后細胞間粘附分子-1（intercellular adh

2、esion molecule-1，ICAM-1）、內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）等表達增加，參與CVD的發(fā)生與發(fā)展。既往研究顯示長期腹透患者出現(xiàn)內(nèi)臟脂肪含量增加，內(nèi)臟脂肪可以分泌多種細胞因子。然而腹透患者內(nèi)臟脂肪增加和腹膜血管新生及CVD發(fā)生之間的關(guān)系目前仍不清楚。
　　目的：探討在腹膜透析中脂肪細胞對血管新生及內(nèi)皮細胞功能紊亂的影響。
　　方法：⑴誘導(dǎo)小鼠前脂肪細胞3T3-L1分化成為脂肪細胞。脂肪細胞分

3、為3組，分別為：對照組；高糖組：培養(yǎng)基所含葡萄糖濃度為139mmol/l；高滲組：培養(yǎng)基滲透壓與高糖組相同。24h后酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immune sorbent assay，ELISA）檢測脂肪細胞上清中VEGF表達量。體外培養(yǎng)小鼠微血管內(nèi)皮細胞，細胞分為6組，分別為：對照組；高糖組：培養(yǎng)基所含葡萄糖濃度為139mmol/l；高滲組：培養(yǎng)基滲透壓與高糖組相同；對照脂肪細胞組：使用脂肪細胞對照組上清干預(yù)內(nèi)皮細

4、胞；高糖脂肪細胞組：使用脂肪細胞高糖組上清干預(yù)內(nèi)皮細胞；高滲脂肪細胞組：使用脂肪細胞高滲組上清干預(yù)內(nèi)皮細胞。12h后觀察內(nèi)皮細胞在Matrigel膠上的管狀結(jié)構(gòu)形成能力、在Transwell板上遷移能力的改變，以及脂肪細胞上清內(nèi)加入VEGF中和抗體對內(nèi)皮細胞管狀結(jié)構(gòu)形成和遷移能力的影響。24h后用Western blot法檢測各組內(nèi)皮細胞ICAM-1、ET-1表達量的變化，并利用p38絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen activat

5、ed protein kinase，MAPK）抑制劑SB203580檢測p38 MAPK信號通路和ICAM-1、ET-1表達的關(guān)系。⑵構(gòu)建前脂肪因子-1（Preadipocyte factor-1，Pref-1）過表達腺相關(guān)病毒（adeno associated virus，AAV）載體，將4周齡雄性C57BL/6小鼠分為4組，即：生理鹽水組：2周齡小鼠腹腔注射100μl磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PB

6、S），并于4周齡開始每天腹腔注射1.5ml生理鹽水；腹透組：2周齡小鼠腹腔注射100μl PBS，并于4周齡開始每天腹腔注射1.5ml4.25％腹透液；腹透+對照病毒組：2周齡小鼠腹腔注射100μl1×1012PFU/ml對照病毒，并于4周齡開始每天腹腔注射1.5ml4.25%腹透液；腹透+目的病毒組：2周齡小鼠腹腔注射100μl1×1012PFU/ml目的病毒，并于4周齡開始每天腹腔注射1.5ml4.25%腹透液。注射周期30天。記錄

7、并觀察小鼠體重及內(nèi)臟脂肪量的改變。CD31免疫組化染色檢測腹膜血管數(shù)量。伊文思藍檢測小鼠腹膜血管通透性。ELISA法檢測小鼠血清VEGF和ICAM-1表達量。
　　結(jié)果：體外實驗中，前脂肪細胞3T3-L1成功誘導(dǎo)分化為脂肪細胞，成脂率>90%。與對照組（1572.50±83.89pg/ml）和高滲組（1803.21±25.94pg/ml）相比，高濃度葡萄糖顯著上調(diào)脂肪細胞 VEGF的表達（2088.36±107.18pg/ml）（

8、P<0.05）。與對照組（12.3±0.6個/HP）相比，高濃度葡萄糖對微血管內(nèi)皮細胞管狀結(jié)構(gòu)形成具有抑制作用（6.3±1.2個/HP）（P<0.01），但脂肪細胞經(jīng)高濃度葡萄糖干預(yù)后的條件培養(yǎng)基可顯著增加內(nèi)皮細胞管狀結(jié)構(gòu)形成的數(shù)量（11.3±1.5個/HP）（P<0.01），高滲透壓在其中并未發(fā)揮主要作用（8.7±0.6個/HP）（P<0.05）。VEGF中和抗體預(yù)處理可顯著降低脂肪細胞高糖條件培養(yǎng)基的促內(nèi)皮細胞管狀結(jié)構(gòu)形成作用（6.

9、3±2.1個/HP）（P<0.05）。與對照組（2.3±1.2個/HP）相比，高濃度葡萄糖可以增加內(nèi)皮細胞在Transwell板上的遷移（6.8±1.7個/HP）（P<0.05）；而和高糖組相比，高濃度葡萄糖干預(yù)后的脂肪細胞條件培養(yǎng)基更顯著得增加了內(nèi)皮細胞的遷移（36.8±2.1個/HP）（P<0.05），同樣，高濃度葡萄糖而非高滲透壓的條件培養(yǎng)基是內(nèi)皮細胞遷移增加的主要原因（31.5±2.6個/HP）（P<0.05）。VEGF中和抗體

10、預(yù)處理也可顯著降低脂肪細胞高糖條件培養(yǎng)基中的內(nèi)皮細胞遷移數(shù)量（23.0±3.2個/HP）（P<0.05）。與高糖組（1.30±0.10）和對照脂肪細胞組（1.13±0.15）相比，高糖脂肪細胞組的內(nèi)皮細胞ICAM-1表達顯著增加（1.53±0.06）（P<0.05），其 ICAM-1表達上調(diào)可以被 p38 MAPK信號通路阻斷劑抑制（0.93±0.12比1.19±0.03）（P<0.05）。而與高糖組（1.49±0.14）和對照脂肪細胞

11、組（1.45±0.25）相比，高糖脂肪細胞組的內(nèi)皮細胞ET-1表達也顯著上調(diào)（2.24±0.27）（P<0.05），但并非由 p38 MAPK信號通路介導(dǎo)（P>0.05）。體內(nèi)實驗中，與生理鹽水組（0.23±0.08g）相比，腹透治療可顯著增加小鼠內(nèi)臟脂肪含量（0.69±0.03g）（P<0.05），而外源性 pref-1基因的表達可以抑制腹透小鼠內(nèi)臟脂肪的生成（0.13±0.03g）（P<0.05）。同時，與生理鹽水組（3.67±1.

12、15個/HP）相比，腹透組小鼠腸系膜血管數(shù)目顯著增加（11.00±2.00個/HP）（P<0.05），而抑制小鼠內(nèi)臟脂肪生成則腹透小鼠腸系膜血管數(shù)顯著較少（8.00±1.00個/HP）（P<0.05）。與生理鹽水組（0.12±0.06）相比，腹透組小鼠腹膜血管通透性增加（0.29±0.03）（P<0.05），而抑制內(nèi)臟脂肪生成后腹透小鼠腹膜血管的通透性顯著降低（0.12±0.06）（P<0.05）。小鼠血清ELISA結(jié)果顯示，腹透治療可

13、上調(diào)小鼠血清VEGF（94.50±16.98pg/ml比46.13±2.98pg/ml）（P<0.05）和 ICAM-1的表達（54.41±10.97pg/ml比20.26±2.81pg/ml）（P<0.05），而減少小鼠內(nèi)臟脂肪生成可以下調(diào)腹透小鼠血清VEGF表達（62.36±11.57pg/ml）（P<0.05）。同樣，抑制腹透小鼠脂肪生成后小鼠血清 ICAM-1表達量也顯著下調(diào)（38.84±8.06pg/ml比54.41±10.9