ZEB2在肝癌血管生成擬態(tài)形成中的作用研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一種常見原發(fā)性惡性腫瘤,具有高轉移率和高復發(fā)率。盡管近年來肝癌的治療手段有了明顯進展,但治療效果仍不盡如人意，患者的生存質量、存活時間都沒有顯著改善。不同于傳統(tǒng)的腫瘤血供模式，血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM)是一種獨特的腫瘤微循環(huán)模式，并且往往關聯(lián)著腫瘤的侵襲、轉移以及不良預后。在 VM形成的分子機制中，有較

2、多的觀點支持上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）參與其中，但兩者之間的調控機制仍不明確。本研究旨在通過分析EMT轉錄因子ZEB2在人肝癌中表達和預后價值，初步揭示ZEB2與VM的關系；通過研究細胞因子TGF-β1對體外肝癌細胞的誘導作用，進一步證實EMT參與肝癌VM形成；通過研究ZEB2對細胞功能的影響，探討ZEB2調控的EMT在肝癌血管生成擬態(tài)形成中的可能作用機制。
　　

3、方法：
　　1）通過特殊染色方法—CD31/PAS雙重染色方法標記肝癌組織中VM管道結構。免疫組織化學染色檢測人肝癌組織中ZEB2的表達并分析ZEB2與VM形成、臨床病理參數的關系以及預后價值。
　　2）選取不能形成管道樣結構的肝癌HepG2細胞系，用細胞因子TGF-β1誘導培養(yǎng)，觀察誘導前后細胞形態(tài)和成管能力的變化。
　　3）Western blot檢測TGF-β1誘導培養(yǎng)后的肝癌細胞EMT轉錄因子Twist1、Sn

4、ail、Slug和ZEB2的表達情況；檢測EMT相關分子E-cadherin，Vimentin及內皮相關分子VE-cadherin的表達情況。
　　4）Western blot檢測四種肝癌細胞系HepG2，Bel7402，PLC和SMMC7221中ZEB2的表達情況。
　　5）篩選出低表達和高表達ZEB2的肝癌細胞系，分別上調和下調ZEB2的表達,并觀察ZEB2高、低表達對細胞成管能力及內皮相關分子表達的影響。
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5、）Western blot和免疫熒光染色檢測ZEB2高、低表達對肝癌細胞EMT相關分子E-cadherin、Vimentin表達的影響。
　　7）細胞劃痕和侵襲實驗檢測ZEB2高、低表達對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響。
　　8）明膠酶譜檢測ZEB2高、低表達對肝癌細胞MMP-2和MMP-9活性的影響。
　　結果：
　　1）92例人肝癌組織樣本中發(fā)現(xiàn)17例存在VM，其發(fā)生率為18％。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)ZEB2細胞漿表

6、達53例（57.6%），ZEB2核表達21例（22.8%）。ZEB2核表達VM形成、臨床分期和肝癌患者的復發(fā)/轉移有關(P<0.05)。生存分析提示具有ZEB2細胞核表達或者VM陽性的肝癌患者總生存期均較短。多因素分析結果表明ZEB2是肝癌患者總生存期的獨立預后因素(P<0.05)。
　　2）TGF-β1誘導培養(yǎng)肝癌HepG2細胞，細胞由典型的上皮樣表型轉變?yōu)殚g充質樣表型并獲得了形成管道樣結構的能力，能在體外形成VM樣結構。

7、>　　3）TGF-β1誘導培養(yǎng)后的HepG2細胞EMT轉錄因子ZEB2的表達顯著增強，而對Twist1、Snail和Slug的影響不明顯；間葉標記分子Vimentin表達增高，而上皮標記分子E-cadherin表達下降；內皮相關分子VE-cadherin表達增高。
　　4）Western blot檢測證實在四種肝癌細胞系HepG2，Bel7402，PLC和SMMC7221
　　中，HepG2細胞低表達ZEB2，Bel7402

8、，PLC和SMMC7221細胞均有較高的ZEB2表達，其中Bel7402細胞表達最高。
　　5）HepG2細胞上調ZEB2表達后在三維培養(yǎng)下能夠形成管道樣結構并表達內皮相關分子VE-cadherin、Flt-1、Flk-1；Bel7402細胞下調ZEB2表達后形成管道樣結構的能力消失并且VE-cadherin、Flt-1、Flk-1的表達顯著下降。
　　6）上調ZEB2表達使HepG2細胞間葉標記分子Vimentin表達增高

9、,而上皮標記分子 E-cadherin表達下降；下調 ZEB2表達使 Bel7402細胞間葉標記分子Vimentin表達下降,而上皮標記分子E-cadherin表達增高。
　　7）上調ZEB2表達能夠增強肝癌HepG2細胞侵襲和遷移能力。下調ZEB2表達降低肝癌Bel7402細胞的侵襲和遷移能力。
　　8）上調ZEB2表達能夠增強肝癌HepG2細胞MMP-2和MMP-9的活性；下調ZEB2表達降低肝癌Bel7402細胞MMP

10、-2和MMP-9的活性。
　　結論：
　　1）通過免疫組化及統(tǒng)計學分析證實ZEB2與VM形成有關；ZEB2還與肝癌復發(fā)、轉移等惡性生物學行為有關,是影響患者生存的獨立預后因素。2）體外實驗通過 TGF-β1誘導培養(yǎng)肝癌細胞，證實其能夠通過顯著上調 ZEB2的表達誘導肝癌細胞發(fā)生EMT，并且促進體外形成VM樣結構。
　　3）體外實驗通過構建ZEB2上、下調細胞模型，證實ZEB2能夠增強肝癌細胞的侵襲、遷移性和三維管狀結構