線粒體融合蛋白2在卵巢功能不全中的表達及與其發(fā)病相關性探討.pdf

1、本文主要從以下幾個方面進行論述:
　　第一部分:Mfn2在卵巢功能不全中的表達研究
　　目的:研究人線粒體融合基因2（Mitofusin2，Mfn2）在卵巢功能不全中的表達水平，對Mfn2與卵巢功能不全發(fā)病關聯性作一初步探索。
　　方法:采集接受體外受精-胚胎移植（IVF-ET）患者的卵泡液，分兩組：卵巢功能正常組（即Normal group）與卵巢功能不全組（即POI group）。依據連續(xù)密度梯度分層的基本原理，使

2、用percoll分離提純顆粒細胞；免疫印跡方法（Western Blot）用以檢測兩組顆粒細胞中Mfn2蛋白的表達；實時熒光定量聚合酶鏈反應（Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）用以檢測兩組顆粒細胞中Mfn2 mRNA的表達；FITC熒光標記的Annexin V以及PI染料染色后兩組顆粒細胞的凋亡評估采用熒光顯微鏡進行。
　　結果:與Normal組相比，

3、POI組Mfn2蛋白和Mfn2 mRNA表達水平均下降，顆粒細胞凋亡增多。
　　結論:卵巢功能不全與顆粒細胞內Mfn2的表達水平具有一定相關性；Mfn2低表達可能通過影響顆粒細胞的凋亡參與卵巢功能不全的發(fā)生。
　　第二部分:Mfn2基因干擾序列及最佳轉染濃度的篩選
　　目的:使用Mfn2小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）對人顆粒細胞進行轉染后優(yōu)選最佳濃度和高效沉默序列。
　　方

4、法:以人Mfn2 mRNA序列作為模板設計并化學合成1對Cy3-siRNA作為對照序列，3對Mfn2-siRNA作為沉默序列。以人卵泡液顆粒細胞作為靶細胞采用不同濃度Cy3-siRNA進行轉染，實驗分5組：0 nM組、20 nM組、30 nM組、50 nM組和100 nM組，熒光顯微鏡觀察不同濃度轉染后顆粒細胞熒光強度差異，優(yōu)選轉染的最佳濃度；利用脂質體2000（Lipofectamine2000，lip2000）的媒介作用，選擇優(yōu)選濃

5、度轉染顆粒細胞，實驗分6組：Blank group（未加lip2000）、Regent group（單加lip2000）、Cy3-siRNA group（轉染lip2000+Cy3-siRNA序列）、Mfn2-siRNA1 group（轉染lip2000+Mfn2-siRNA序列1）、Mfn2-siRNA2 group（轉染lip2000+Mfn2-siRNA序列2）、Mfn2-siRNA3 group（轉染lip2000+Mfn2-s

6、iRNA序列3），運用Western Blot技術和qRT-PCR技術檢測各組Mfn2蛋白和mRNA的表達水平，篩選出沉默效果最好的轉染序列。
　　結果:以不同濃度的Cy3-siRNA轉染顆粒細胞后，熒光顯微鏡觀察發(fā)現50nM和100nM轉染濃度時熒光強度最強。qRT-PCR和Western Blot結果顯示不同Mfn2-siRNA序列轉染后Mfn2 mRNA和蛋白表達水平均下降，其中Mfn2-siRNA序列3下降最為顯著。

7、>　　結論:基于經濟有效原則，在達到實驗要求轉染效率的基礎上，選擇50nM作為轉染人卵泡液顆粒細胞的優(yōu)選濃度。Mfn2-siRNA序列3轉染細胞后Mfn2表達水平最低，說明沉默效果最佳，因此確定其為最佳轉染序列。
　　第三部分:Mfn2與卵巢功能不全發(fā)病相關性探討
　　目的:觀察顆粒細胞中Mfn2沉默后表達水平差異對線粒體代謝、凋亡相關基因表達及顆粒細胞凋亡的影響，揭示Mfn2在卵巢功能不全中的可能作用機制。
　　方法

8、:收集卵巢功能正?；颊呗雅菀海捎妹芏忍荻入x心法分離純化的顆粒細胞作為靶細胞，以lip2000為介質，分別使用Mfn2基因沉默最優(yōu)序列（Mfn2-siRNA3）和對照序列（Cy3-siRNA）進行轉染，實驗分兩組：對照組（Cy3-siRNA group）和沉默組（Mfn2-siRNA group）。運用qRT-PCR技術和Western Blot技術分別檢測Mfn2 mRNA和蛋白的表達水平，明確沉默有效；分別采用熒光顯微鏡觀察和流式細

9、胞技術檢測兩組顆粒細胞中線粒體膜電位和顆粒細胞凋亡情況；凋亡相關蛋白CytC、Caspases9、Caspases3、Bax、Bcl2的表達運用Western Blot技術進行檢測，以明確顆粒細胞凋亡的分子機制。
　　結果:與對照組相比，沉默組Mfn2mRNA和蛋白表達水平降低；線粒體膜電位下降，顆粒細胞凋亡增加；凋亡相關蛋白CytC、Caspases9、Caspases3、Bax表達水平均增加，Bcl2表達水平降低。