Rictor-mTORC2通路在卵子發(fā)生與早發(fā)性卵巢功能不全中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、一、研究背景與目的
　　早發(fā)性卵巢功能不全(Premature Ovarian Insufficiency，POI)是指女性40歲之前，原發(fā)性或繼發(fā)性閉經(jīng)至少4月（排除妊娠后），血清性激素水平低下（主要是E2）、抗苗勒氏管激素降低，和促性腺激素水平升高（主要是FSH），伴隨生育力的喪失。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，職場女性精神壓力劇增，加至基因、環(huán)境因素的綜合影響，POI的發(fā)病率呈上升趨勢。POI患者由于功能性卵泡的喪失，面臨不育、更

2、年期綜合征等一系列健康問題，也提高了心血管疾病，骨質(zhì)疏松骨折、老年癡呆等老年退行性疾病的易感性，嚴(yán)重影響女性的生存質(zhì)量。POI的發(fā)病機(jī)制非常廣泛，包括染色體基因異常、自身免疫病多器官受累、代謝因素、感染和醫(yī)源性因素等。不同于自然狀態(tài)的更年期，約50％的POI患者卵巢功能不可預(yù)知，約5％～10％的患者，在診斷POI后，仍然可以妊娠、分娩。大約65％的POI患者屬于特發(fā)性，無病因可循，而且在出現(xiàn)臨床癥狀之前，卵泡耗竭已經(jīng)發(fā)生。故探索卵泡衰竭

3、的分子機(jī)制，了解卵子發(fā)生、凋亡閉鎖的機(jī)理，可為臨床POI的治療策略提供新思路。哺乳動(dòng)物的卵子發(fā)生是一個(gè)循序漸進(jìn)的過程，經(jīng)歷復(fù)雜的形態(tài)變化和細(xì)胞分化。由初級卵母細(xì)胞經(jīng)過一系列減數(shù)分裂和形態(tài)變化，形成成熟卵子的過程稱為卵子發(fā)生。卵泡生長指靜止休眠狀態(tài)的始基卵泡，被募集選擇，發(fā)生一系列生化和形態(tài)變化，直至卵泡成熟，周期性排卵或卵泡凋亡閉鎖。當(dāng)獲能的精子穿透次級卵母細(xì)胞透明帶，產(chǎn)生頂體反應(yīng)，卵母細(xì)胞迅速完成第二次成熟分裂，卵原核和精原核的染色體

4、融合，形成二倍體的受精卵。GCs及卵泡膜細(xì)胞對正常卵子發(fā)生至關(guān)重要，卵泡數(shù)量不足或卵泡凋亡閉鎖加速，將導(dǎo)致POI。然而，參與卵子發(fā)生過程中的一些信號通路，尤其是一些新的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其調(diào)節(jié)機(jī)制仍不明確，探索這些信號通路在卵子發(fā)生，以及POI中的分子機(jī)制仍將是今后研究的熱點(diǎn)。
　　哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(Mechanistic target of rapamycin，mTOR)是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可接受并整合細(xì)胞

5、內(nèi)和細(xì)胞外的各種信號通路的刺激，如激素、生長因子、營養(yǎng)、能量代謝等，進(jìn)而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的翻譯、細(xì)胞的生長、存活、自噬與代謝等生理過程。在細(xì)胞內(nèi)，mTOR以mTORC1/2兩種復(fù)合物的形式存在，其形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的改變，與復(fù)合物存在的形式有關(guān)。而且二者在功能上截然不同，分別接受各自的上游蛋白信號，調(diào)節(jié)各自下游蛋白的生理功能。其中，mTORC1的活性能特異性地被雷帕霉素所抑制，mTORC2中含有雷帕霉素不敏感的組分Rictor，故其活性不受雷帕霉

6、素的影響。關(guān)于Rictor蛋白的結(jié)構(gòu)及各結(jié)構(gòu)域的作用與上、下游的調(diào)節(jié)機(jī)制了解較少，目前認(rèn)為Rictor/mTORC2可磷酸化Akt(Ser473)，促進(jìn)細(xì)胞存活與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重組。
　　mTORC2在卵泡發(fā)育與POI中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制亦不清楚，最近有研究發(fā)現(xiàn)去氧乙烯基環(huán)己烯(4-vinylcyclohexene diepoxide，VCD)在誘導(dǎo)卵泡大量凋亡的同時(shí)，能抑制卵泡中PI3K信號通路的活性。VCD是生產(chǎn)殺蟲劑、滅火劑、塑

7、料和橡膠等的中間產(chǎn)物，由于其具有嚴(yán)重的卵巢毒性，會(huì)導(dǎo)致女性POI而喪失生育能力。我們在前期的工作中發(fā)現(xiàn)4-VCD在導(dǎo)致POI的同時(shí)，抑制了Rictor/mTORC2信號通路的活性，但Rictor/mTORC2在卵泡發(fā)育與POI發(fā)生中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。
　　本課題通過Cre-loxP重組酶系統(tǒng)，構(gòu)建卵泡特異敲除Rictor的小鼠為模型，結(jié)合4-VCD導(dǎo)致POI動(dòng)物模型，應(yīng)用組織學(xué)，胚胎學(xué)及細(xì)胞分子生物學(xué)方法，從分子、細(xì)胞與整

8、體水平闡明mTORC2在卵子發(fā)育和成熟、卵泡凋亡閉鎖、卵巢功能及早期胚胎發(fā)育中的作用，并探討其可能的調(diào)控機(jī)制，為卵子發(fā)生的調(diào)節(jié)機(jī)制和POI的發(fā)病機(jī)制提供新內(nèi)容，為女性POI相關(guān)疾病的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。
　　二、研究方法
　　1、應(yīng)用Cre-loxP系統(tǒng)（Rictor-loxp、ZP3-cre）構(gòu)建卵泡細(xì)胞特異性Rictor基因敲除小鼠。應(yīng)用PCR和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行小鼠基因型的鑒定，用western blot

9、和免疫組織化學(xué)確定基因敲除效果。
　　2、通過HE染色、免疫組織化學(xué)以及免疫熒光技術(shù)分析Rictor/mTORC2對小鼠子宮大小，卵巢組織形態(tài)和各級卵泡和黃體數(shù)量的影響。
　　3、通過TUNEL檢測Rictor/mTORC2對小鼠卵泡發(fā)育凋亡閉鎖的影響。
　　4、通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)對敲除小鼠血液進(jìn)行生化分析，檢測Rictor/mTORC2對小鼠血清性激素變化的影響。
　　5、通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測R

10、ictor/mTORC2對小鼠卵母細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。
　　6、通過免疫熒光技術(shù)、western blot技術(shù)、Pulldown以及免疫共沉淀技術(shù)分析Rictor/mTORC2對卵泡凋亡和卵巢內(nèi)分泌、胚胎發(fā)育的影響及相關(guān)的分子機(jī)制。
　　7、通過給予正常小鼠4-VCD處理，建立POI動(dòng)物模型，探討Rictor基因在此模型中的作用。
　　三、研究結(jié)果
　　14-VCD破壞早期卵泡發(fā)育，并且抑制卵泡Rictor/mT

11、ORC2信號通路的活性
　　為了探討mTORC2在POI中的作用，首先在4-VCD處理后的卵巢中對mTORC2信號通路的中心成分Rictor的活性進(jìn)行檢測。與對照鼠相比，VCD處理的小鼠中始基卵泡的數(shù)量減少了45％，初級卵泡減少了55％，但VCD對更高級的卵泡作用很微弱，對照組與處理組之間基本相近。有趣的是，在VCD處理過的卵巢中，Rictor的一種活性抑制狀態(tài)——磷酸化Rictor(p-Rictor，Thr-1135)的表達(dá)水平

12、明顯上升。眾所周知，Rictor作為mTORC2的核心組分通過在各種環(huán)境下磷酸化并活化Akt，并通過Akt磷酸化并抑制作為細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)錄因子Foxo3a的活性來促進(jìn)細(xì)胞的存活。與預(yù)期的相一致，VCD處理后，卵巢中p-Akt(Ser-473)和p-Foxo3a(Ser-253)的表達(dá)量減少了。與此同時(shí)，三種經(jīng)典的促凋亡蛋白Bad，Bax和cleaved-PARP的表達(dá)量明顯上升。作為SGK1的活性指標(biāo)，NDGR1在Thr-346位點(diǎn)的磷酸化

13、在對照組和VCD處理組小鼠的結(jié)果很接近，這說明mTORC2的另一種下游底物血清-糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型蛋白激酶1(SGK1)并沒有改變。另外，我們發(fā)現(xiàn)S6K1的活性(p-S6K1，Thr-389)表達(dá)量反而上升。這些結(jié)果與前人報(bào)道的體內(nèi)結(jié)果一致，S6K1介導(dǎo)RictorThr-1335位點(diǎn)的直接磷酸化，進(jìn)而抑制S6K1的活性，形成了一個(gè)依賴于mTORC1并針對mTORC2的抑制反饋回路。Rictor的磷酸化與失活在VCD介導(dǎo)的卵泡凋亡中可能發(fā)

14、揮重要作用。
　　2卵母細(xì)胞中Rictor基因的缺失模擬POI的表型
　　為了進(jìn)一步闡明Rictor/mTORC2對卵泡存活的作用，應(yīng)用Cre-loxp系統(tǒng)成功構(gòu)建了卵母細(xì)胞特異性敲除Rictor的小鼠。與所預(yù)期的一樣，在同窩的對照組小鼠的卵泡中檢測到了Rictor的表達(dá)，而在敲除小鼠內(nèi)并沒有發(fā)現(xiàn)，這說明Cre酶成功實(shí)現(xiàn)了對Rictor基因的重組，卵泡細(xì)胞特異性敲除Rictor的小鼠構(gòu)建成功。同時(shí)，Rictor基因的缺失也引

15、起了p-Akt(Ser-473)表達(dá)量的降低。有趣的是，mTORC1的下游靶蛋白p-S6(S235/S236)的表達(dá)明顯減少，這個(gè)現(xiàn)象在黃體中尤為明顯。以往的研究表明，mTORC2通過激活A(yù)kt進(jìn)而抑制mTORC1的負(fù)調(diào)控因子(TSC1/2)來活化mTORC1，由此可見，我們的研究結(jié)果與以往報(bào)道的結(jié)果高度一致。
　　我們進(jìn)一步檢測了Rictor/mTORC2信號通路下游蛋白的表達(dá)。Rictor的缺失引起了p-Foxo3a的表達(dá)減少

16、，同時(shí)，Bad，Bax和cleaved PARP表達(dá)增多。免疫組化的結(jié)果也通過Western Blot分析得到了證實(shí)。由此可見，卵母細(xì)胞中特異性敲除Rictor所引起的控制卵泡生存的潛在信號通路的變化與VCD基本一致。這些結(jié)果一致表明Rictor在mTORC2/Akt/Foxo3a/促凋亡蛋白信號軸調(diào)控卵泡凋亡過程中的起著核心作用。
　　3卵巢中Rictor缺失引起卵泡細(xì)胞凋亡和卵泡丟失
　　隨后，我們檢測了敲除小鼠中卵泡的

17、數(shù)量。敲除小鼠的外形和體格生長發(fā)育正常，但子宮則較對照鼠小，在8月齡時(shí)，子宮重量只有對照鼠的45％(p＜0.05)。隨后對敲除小鼠的卵巢進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)健康卵泡和黃體的數(shù)量均明顯減少，同時(shí)閉鎖卵泡明顯增多，這一結(jié)果與促凋亡蛋白的過度表達(dá)是相吻合的。需要引起注意的是，在8月齡的敲除小鼠中，卵泡數(shù)量很少，幾乎很難觀察到。為了更精確地判斷Rictor基因敲除對卵泡減少的影響，我們對每個(gè)卵巢選取了5張切片，對不同發(fā)育階段的卵泡進(jìn)行了分類和計(jì)

18、數(shù)。與對照鼠相比，6月齡時(shí)，條件敲除小鼠的健康卵泡減少了40％，黃體減少了50％。至8月齡時(shí)，敲除小鼠的健康卵泡減少了67％，黃體減少了71％(p＜0.001)，這表明卵泡細(xì)胞缺失Rictor基因，導(dǎo)致卵巢出現(xiàn)卵泡漸進(jìn)性丟失。眾所周知，排卵后殘留的卵泡壁塌陷，卵泡膜的結(jié)締組織、毛細(xì)血管等伸入到顆粒細(xì)胞(GCs)層，在LH作用下演變成體積較大，富含毛細(xì)血管并具有內(nèi)分泌功能的黃體。黃體中GCs占大多數(shù)，黃體數(shù)量的減少意味著排卵的減少，或者提

19、示可供發(fā)育成熟并排卵的卵泡儲備不足。造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于卵泡的過度耗竭，使得竇前卵泡到竇狀卵泡、成熟卵泡的發(fā)育過程受阻所致。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，過度的卵泡凋亡可能是更主要的因素，我們發(fā)現(xiàn)在敲除小鼠的卵巢中檢測到了更多的閉鎖卵泡(p＜0.01)。為了進(jìn)一步確定卵泡耗損具體發(fā)生在卵泡發(fā)育的哪個(gè)階段，我們進(jìn)一步分析了各個(gè)發(fā)育階段卵泡的數(shù)量。盡管相對于對照鼠，敲除小鼠小卵泡（包括始基卵泡和初級卵泡）的數(shù)量降低，但是差異并不明顯。前人的研究

20、已經(jīng)證實(shí)Zp3-Cre介導(dǎo)的基因敲除發(fā)生在初級卵泡以及其之后的發(fā)育卵泡的卵母細(xì)胞上，從常理上講，卵泡中Rictor基因的缺失應(yīng)該不會(huì)引起始基卵泡的大量損失，這與實(shí)際上觀察到的結(jié)果是相吻合的(p＜0.01)。此外，在8月齡的條件敲除小鼠的卵巢中觀察到了竇卵泡和成熟卵泡的大量凋亡，這一結(jié)果與條件敲除小鼠卵巢中促凋亡蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)的結(jié)果是一致的。以上結(jié)果表明，卵巢中Rictor基因的缺失促進(jìn)了卵母細(xì)胞的凋亡，從而引起卵泡的大量耗損，由此

21、導(dǎo)致卵巢儲備功能降低。
　　4卵母細(xì)胞內(nèi)Rictor敲除導(dǎo)致小鼠生育能力下降
　　通常情況下，卵泡儲備的下降會(huì)導(dǎo)致雌鼠生育能力的下降。為了進(jìn)一步檢測條件敲除小鼠的生育能力，我們分別將4、6、8月齡的對照小鼠和敲除小鼠與已被證實(shí)有生育能力的野生型C57雄鼠進(jìn)行交配。正如所預(yù)期的一樣，敲除小鼠隨著年齡的增大，生育能力下降。所有對照小鼠均成功妊娠，并正常分娩幼崽，然而在敲除小鼠組，4月齡和6月齡組內(nèi)各有1只(11％)在為期兩個(gè)月的

22、觀察期內(nèi)未能成功受孕。更嚴(yán)重的是，所有8月齡的條件敲除小鼠都出現(xiàn)不育。值得注意的是，來自4月齡組的1只小鼠(11％)和來自6月齡組的4只小鼠產(chǎn)褥期死亡，同時(shí)伴發(fā)稽留流產(chǎn)和死胎。并且，在敲除小鼠組，成活的幼崽數(shù)明顯比對照組的少，成功分娩率較對照小鼠降低。因此，敲除小鼠的生殖能力隨著年齡的增長而下降，而且自8月齡開始出現(xiàn)不育。
　　5卵母細(xì)胞內(nèi)Rictor敲除小鼠的激素分泌異常
　　作為生殖腺，卵巢在很大程度上受促性腺激素（如F

23、SH和LH）的調(diào)節(jié)，同時(shí)分泌性激素（如E2、P4）。因此，我們檢測了敲除小鼠的性激素水平。敲除小鼠FSH和LH的水平都比對照鼠相應(yīng)的激素水平高，但差異并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.01)。考慮到敲除小鼠出現(xiàn)卵泡發(fā)育的阻滯和不排卵的表型，并且因?yàn)镕SH促進(jìn)卵泡發(fā)育，LH調(diào)節(jié)排卵，所以這些變化可能預(yù)示著存在某種正反饋效應(yīng)。與此相反，敲除小鼠的雌二醇和孕酮的分泌都明顯下降(p＜0.01)，尤其是孕酮，與對照鼠的孕酮水平相比幾乎減少了一半(p＜0.

24、05)。黃體是雌性體內(nèi)雌二醇的重要分泌源和孕酮的唯一來源，敲除小鼠卵母細(xì)胞凋亡，成熟卵泡減少，排卵減少，功能性黃體減少，自然引起性激素分泌的不足，間接導(dǎo)致了生育能力的下降。
　　6來自于母本的Rictor基因?qū)ε咛グl(fā)育來說可能是非必需的
　　因?yàn)閆p3-Cre介導(dǎo)的基因重組特異的發(fā)生在卵母細(xì)胞中，所以，它不僅是一個(gè)非常好用的工具，用于研究目的基因在卵子生成過程中的生理功能，還被廣泛的用于探索胚胎發(fā)育期間母系遺傳的影響。最近一

25、項(xiàng)研究利用破壞多等位基因的方法使Rictor基因失活，發(fā)現(xiàn)mTORC2對胚胎生長和發(fā)育發(fā)揮重要的作用。為了進(jìn)一步明確來自母本的Rictor基因?qū)ε咛グl(fā)育是否必需，我們將性成熟的雌性敲除小鼠（Zp3-Cre+，Rictorloxp/loxp，排卵后的卵母細(xì)胞細(xì)胞缺失Rictor基因）和對照小鼠（Zp3-Cre-，Rictorloxp/loxp，正常的卵母細(xì)胞）與具有生育能力的野生型C57雄鼠交配。在這個(gè)交配組合中，來自于條件敲除小鼠卵泡細(xì)

26、胞的胚胎缺少母系遺傳的Rictor基因，產(chǎn)生具有-/Rictor基因型的胚胎。但是我們并沒有觀察到對照小鼠和敲除小鼠胚胎之間有任何明顯的解剖或組織學(xué)上的差異。雖然在每個(gè)特定觀察時(shí)間點(diǎn)(E5，E10，E15)條件敲除小鼠的胚胎數(shù)目較對照組少，但是在整個(gè)觀察期中（E5到E10），對照組和條件敲除組小鼠胚胎的總數(shù)分別保持相對穩(wěn)定，在E5時(shí)，對照組是57個(gè)胚胎，敲除組是45個(gè)，比對照少。同樣，其它兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)也是如此。但對于敲除組來說，從45到4

27、1，再到42，從時(shí)間點(diǎn)的變化上看數(shù)量相對穩(wěn)定，也就是在胚胎發(fā)育過程中胚胎并沒有明顯減少，不會(huì)在發(fā)育過程中因?yàn)榕咛ギ惓６劳?。而每個(gè)時(shí)間點(diǎn)胚胎數(shù)量減少是因?yàn)槁雅葸^度凋亡，卵巢排卵少導(dǎo)致的。這證明母系遺傳的Rictor基因缺陷對正常胚胎發(fā)育沒有影響。此外，對照鼠和敲除小鼠的胚胎在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均數(shù)量很接近。除此之外，組織形態(tài)學(xué)分析顯示條件敲除小鼠E16的胎盤并無沒有明顯的形態(tài)學(xué)和組織學(xué)異常，而且滋養(yǎng)層細(xì)胞的標(biāo)志蛋白-胎盤催乳素(PL-1)，

28、與對照小鼠的表達(dá)和分布基本一致。盡管條件敲除小鼠死胎發(fā)生率增加，但是幼崽外觀并沒有任何明顯的發(fā)育缺陷。但是對照鼠和條件敲除小鼠的子宮組織學(xué)差異顯著，條件敲除小鼠子宮腔的體積更小，而且分泌腺也明顯減少，這些子宮組織形態(tài)學(xué)的異常很容易導(dǎo)致胚胎丟失。這些結(jié)果表明，僅僅具有父系遺傳的Rictor基因?qū)τ谡麄€(gè)胚胎發(fā)育過程已經(jīng)足夠了。
　　綜上所述，4-VCD破壞早期卵泡的發(fā)育，并且抑制Rictor/mTORC2信號通路的活性，小鼠卵泡中Ri

29、ctor基因缺失，導(dǎo)致POI，主要表現(xiàn)為過度的卵泡凋亡和閉鎖，進(jìn)而導(dǎo)致小鼠生育力的下降，敲除小鼠的FSH和LH水平比正常對照鼠的高。來自于母本的Rictor基因?qū)ε咛グl(fā)育來說可能是非必需的。
　　四、結(jié)論
　　1、在VCD誘導(dǎo)的小鼠POI模型中，Rictor/mTORC2信號通路的活性下降;
　　2、成功構(gòu)建了卵泡特異性敲除Rrictor的條件基因敲除小鼠模型;
　　3、卵泡中Rictor基因缺失引起引起小鼠卵泡

30、過度凋亡和閉鎖，出現(xiàn)POI的表型;
　　4、Rictor在mTORC2/Akt/Foxo3a/促凋亡蛋白信號軸調(diào)控卵泡凋亡的過程中起核心作用;
　　5、卵泡Rictor基因敲除的小鼠生育力下降;
　　6、來自于母本的Rictor基因?qū)ε咛グl(fā)育來說可能是非必需的。
　　綜合上述，本研究發(fā)現(xiàn)Rictor/mTORC2在卵子發(fā)生、卵泡細(xì)胞存活與維持雌性生殖能力中起重要作用，卵泡特異性敲除Rictor的小鼠是研究POI的