C10ORF2，HELQ和PRIM1基因在原發(fā)性卵巢功能不全中的作用和相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、本文分以下幾個(gè)章節(jié)進(jìn)行探討：
　　第一章 線粒體相關(guān)基因C10ORF2在家族性原發(fā)性卵巢功能不全合并感音神經(jīng)性耳聾(Perrault綜合征)發(fā)病中的作用和機(jī)制研究
　　第一節(jié) Perrault綜合征家系全外顯子組測(cè)序研究
　　目的:原發(fā)性卵巢功能不全(POI)是一種高度異質(zhì)性、病因復(fù)雜的婦科內(nèi)分泌疾病，患者通常在40歲以前就出現(xiàn)閉經(jīng)，發(fā)病率約為1％。該疾病的特點(diǎn)是原發(fā)性或繼發(fā)性閉經(jīng)并且伴隨不同程度的低雌激素癥狀。目前尚

2、沒有可靠的早期診斷指標(biāo)，也不能早期有效的預(yù)防該疾病的發(fā)生和進(jìn)展，因而病因研究和早期識(shí)別高風(fēng)險(xiǎn)人群是十分重要的。原發(fā)性卵巢功能不全主要分為綜合征型POI和非綜合征型POI兩種，并在兩種類型中分別篩選出了多個(gè)致病基因。其中已發(fā)現(xiàn)的綜合征型POI包括脆X綜合征、小瞼裂綜合征(BPES)、半乳糖血癥、碳水化合物缺乏糖蛋白綜合征Ⅰ型、Perrault綜合征(PS)等，通過全外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn)Perrault綜合征患者的致病基因包括HARS2、LAR

3、S2、C10ORF2、CLPP等。Perrault綜合征患者在患有感音神經(jīng)性耳聾的同時(shí)，女性患者還伴有典型的原發(fā)性卵巢功能不全癥狀。我們對(duì)先證者及家系其他成員進(jìn)行全外顯子組測(cè)序，以期發(fā)現(xiàn)新的POI致病基因。
　　方法:對(duì)該P(yáng)errault綜合征中先證者、患病姐妹以及父母采用AgilentSureSelect Human All Exon.V5技術(shù)對(duì)全外顯子組進(jìn)行測(cè)序，將檢出的全部單堿基改變、插入/缺失與公共數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)排除已知多態(tài)，

4、之后檢出造成氨基酸改變的非同義突變，再根據(jù)孟德爾遺傳定律篩出候選位點(diǎn)。最后按照常染色體隱性遺傳的方式進(jìn)行基因篩選，且在患者中篩選出共同的純合突變位點(diǎn)。
　　結(jié)果:全外顯子組測(cè)序后發(fā)現(xiàn)了符合常染色體隱性遺傳的一個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)，該突變位于C10ORF2基因的c.1388G＞A(p.R463 Q)位點(diǎn)，屬于一個(gè)新發(fā)的錯(cuò)義突變，該突變使該位置的氨基酸由精氨酸變?yōu)楣劝滨０??；颊邽榧兒贤蛔儯l(fā)生于編碼蛋白的解旋酶區(qū)域。C10ORF2基因的解

5、旋酶作用對(duì)線粒體的復(fù)制至關(guān)重要，推測(cè)該突變導(dǎo)致的蛋白功能改變影響了細(xì)胞線粒體功能，從而導(dǎo)致了Perrault綜合征的發(fā)生。
　　結(jié)論:通過外顯子測(cè)序技術(shù)在C10ORF2基因的解旋區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了新發(fā)錯(cuò)義突變位點(diǎn)，該基因突變的發(fā)現(xiàn)為從線粒體功能方面探索POI的機(jī)制研究提供了新的方向。
　　第二節(jié) C10ORF2基因在原發(fā)性卵巢功能不全中的作用機(jī)制研究
　　目的:在原發(fā)性卵巢功能不全伴隨感音神經(jīng)性耳聾患者(PS)家系中，我們通

6、過全外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn)了位于C10ORF2基因上的錯(cuò)義突變位點(diǎn)c.1388G＞A(p.R463Q)。在既往研究中，發(fā)現(xiàn)位于同一位點(diǎn)的其他氨基酸改變導(dǎo)致患者嬰兒脊髓小腦發(fā)育不全的嚴(yán)重表現(xiàn)。C10ORF2基因編碼的DNA解旋酶參與了真核細(xì)胞內(nèi)線粒體復(fù)制過程，而線粒體作為顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞內(nèi)含量豐富的細(xì)胞器，調(diào)節(jié)了顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的代謝、細(xì)胞周期和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。但目前該基因功能與卵巢的關(guān)系尚無報(bào)道。本課題通過研究C10ORF2突變導(dǎo)致細(xì)胞線粒

7、體功能發(fā)生的變化，探討C10ORF2基因突變引發(fā)POI的致病機(jī)制。
　　方法:通過收集Perrault綜合征患者家系外周血，提取先證者外周血液DNA，建立C10ORF2基因c.1388G＞A(p.R463Q)位點(diǎn)突變的永生化淋巴細(xì)胞系，檢測(cè)患者外周血永生細(xì)胞內(nèi)線粒體ATP產(chǎn)生，線粒體拷貝數(shù)以及細(xì)胞內(nèi)ROS的生成等，研究C10ORF2基因突變導(dǎo)致的細(xì)胞線粒體功能變化。
　　結(jié)果:通過提取患者外周血并構(gòu)建永生化淋巴細(xì)胞進(jìn)行功能實(shí)

8、驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)C10ORF2基因突變導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)ATP產(chǎn)生減少，ROS水平升高，并發(fā)現(xiàn)C10ORF2基因突變的永生化淋巴細(xì)胞內(nèi)線粒體拷貝數(shù)也明顯低于正常入水平。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該基因突變嚴(yán)重影響了細(xì)胞內(nèi)線粒體的活力和氧化磷酸化水平，導(dǎo)致了線粒體功能障礙。
　　結(jié)論:在C10ORF2基因中，c.1388G＞A(p.R463 Q)位點(diǎn)突變嚴(yán)重影響了細(xì)胞的線粒體功能。如果該突變發(fā)生在卵巢內(nèi)，將阻礙卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的正常能量代謝，使

9、卵母細(xì)胞成熟障礙。如果線粒體功能嚴(yán)重缺陷，使細(xì)胞ATP生成減少及ROS累積增多，將導(dǎo)致卵母細(xì)胞無法代償而發(fā)生死亡。因此，C10ORF2基因突變導(dǎo)致的卵巢內(nèi)線粒體內(nèi)能量代謝障礙可能是導(dǎo)致POI的重要機(jī)制之一。
　　第二章 HELQ基因在原發(fā)性卵巢功能不全患者中的突變分析
　　目的:本研究旨在通過對(duì)漢族POI患者進(jìn)行HELQ基因的外顯子測(cè)序，明確該基因在POI患者中的突變情況，為POI病因?qū)W研究及臨床遺傳咨詢與生育指導(dǎo)提供理論依

10、據(jù)。
　　方法:選取在2012至2014年就診于山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院的中國(guó)漢族POI患者192例，將其血液DNA提取后，進(jìn)行HELQ基因全部外顯子及外顯子與內(nèi)含子鄰接部位測(cè)序。所測(cè)結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中國(guó)漢族北方正常人群進(jìn)行序列比對(duì)，用SPSS軟件將SNP位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:在HELQ基因外顯子測(cè)序中發(fā)現(xiàn)6個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，其中rs1494961，rs2047210兩個(gè)位點(diǎn)經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，基因型

11、和等位基因頻率與對(duì)照組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，rs13141136，rs7665103，rs11099600，rs12645412與對(duì)照人群比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但屬于同義改變。
　　結(jié)論:首次在中國(guó)漢族原發(fā)性卵巢功能不全患者中篩查了HELQ基因的編碼序列，發(fā)現(xiàn)HELQ基因突變不是原發(fā)性卵巢功能不全的常見原因。
　　第三章 PRIM1基因在原發(fā)性卵巢功能不全患者中的突變分析及基因敲除小鼠研究
　　第一節(jié) PRIM1基因在原發(fā)性

12、卵巢功能不全患者中的突變分析
　　目的:近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性卵巢功能不全和早絕經(jīng)之間具有共同的遺傳易感性，為探索POI的致病機(jī)制提供了一個(gè)新的方向。有研究通過全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)了13個(gè)與絕經(jīng)年齡相關(guān)的位點(diǎn)，其中包括PRIM1基因。PRIM基因不僅與自然絕經(jīng)年齡密切相關(guān)，并且后續(xù)在歐洲人群中的研究發(fā)現(xiàn)PRIM1基因的非同義多態(tài)性位點(diǎn)rs2277339與早絕經(jīng)和POI也有顯著相關(guān)性。PRIM1基因編碼的DNA引發(fā)酶主要參

13、與DNA復(fù)制過程，在合成岡崎片段時(shí)通過促進(jìn)合成RNA引物來完成DNA的合成。本研究旨在通過對(duì)192例中國(guó)漢族POI患者進(jìn)行PRIM1編碼序列測(cè)定，從而確定該基因突變是否導(dǎo)致POI的發(fā)生。
　　方法:選取2014年至2015年就診于山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院的192例POI病人為研究對(duì)象，應(yīng)用直接測(cè)序技術(shù)進(jìn)行PRIM1基因編碼區(qū)域測(cè)序即基因突變篩查，所獲結(jié)果與Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)中正常中國(guó)北方人群作為對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，用SPSS軟件將SN

14、P位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:在POI病人中篩查出3個(gè)已知SNP位點(diǎn)rs2277339，rs1131514和rs1026565，分別位于外顯子1，外顯子10和內(nèi)含子6中，它們的基因型和等位基因頻率在POI和對(duì)照組數(shù)據(jù)中相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:PRIM1基因突變?cè)谥袊?guó)漢族原發(fā)性卵巢功能不全患者中并不常見。雖然在歐洲人群中rs2277339位點(diǎn)與原發(fā)性卵巢功能不全相關(guān)，但在中國(guó)漢族POI婦女中并無

15、意義，可能由種族差異性或本研究的樣本量較少導(dǎo)致。PRIM1基因在POI發(fā)病中的作用尚需繼續(xù)深入研究。
　　第二節(jié) Prim1基因敲除小鼠的生育力分析
　　目的:在原發(fā)性卵巢功能不全的遺傳學(xué)研究中不僅需要基因組學(xué)的研究為尋找新的致病位點(diǎn)提供依據(jù)，而探索POI致病機(jī)制過程中更需要?jiǎng)游矬w內(nèi)實(shí)驗(yàn)的生物學(xué)支持。因此，在進(jìn)行PRIM1基因篩查的同時(shí)，為了評(píng)估PRIM1基因在體內(nèi)的生理作用，我們構(gòu)建了Prim1基因敲除小鼠，研究該基因的缺

16、失是否影響小鼠生長(zhǎng)發(fā)育及生殖功能。
　　方法:采用CRISPR/Cas9技術(shù)，在該靶基因內(nèi)尋找Cas9切點(diǎn)，設(shè)計(jì)、構(gòu)建對(duì)應(yīng)的gRNA序列，測(cè)試其核酸內(nèi)切活性后，與Cas9 mRNA共同注射小鼠單細(xì)胞胚，繁育后取得F1代雜合子Prim1+/-小鼠。通過合籠后記錄生育子代數(shù)，子代基因型比例，卵巢形態(tài)，大小和卵巢內(nèi)各級(jí)卵泡數(shù)目等研究Prim1基因缺失對(duì)小鼠生殖系統(tǒng)的影響。
　　結(jié)果:Prim1+/-小鼠合籠后沒有純合子Prim1-