NF-κB-HSP27路徑在熱應激致內皮細胞凋亡中作用機制的研究.pdf

1、目的:
　　本研究在于探討熱打擊誘導內皮細胞凋亡的具體機制，闡明介導熱打擊誘導細胞凋亡的信號通路、上游信號分子以及中間環(huán)節(jié)各信號分子之間的相互作用，從分子水平上了解熱打擊誘導內皮細胞凋亡機制，為揭示中暑內皮細胞介導的病理過程奠定基礎，也為臨床中暑預防和治療提供理論依據(jù)。
　　方法和結果:
　　1.分離人臍靜脈內皮細胞并建立熱應激模型，熱應激恢復期NF-κB是否發(fā)生活化及其具體其活化機制
　　按照參考文獻分離人臍靜

2、脈內皮細胞并用用VE-cadherin和VEGFR-2鑒定細胞表型。43℃，90min熱打擊后不同復溫時間點(0、2、6、12h)及37℃對照組細胞，使用熒光顯微鏡觀察NF-κBp65的定位。并提取胞漿胞核蛋白，使用Westem blotting定量分析其在核內水平，使用試劑盒檢測NF-κBp65的DNA連接活性。Western blotting檢測IKK-α/β、IκB-α、p65表達及磷酸化水平變化。熱應激早期并不能使NF-κB發(fā)生

3、活化，隨著恢復期延長NF-κB可發(fā)生活化，熱打擊早期及恢復期并不能使得IKK-α/β發(fā)生磷酸化，但IκB噸在熱應激早期及恢復期均發(fā)生磷酸化，但未發(fā)生降解。p65在熱應激早期未發(fā)生磷酸化，但在恢復期可被激活從而發(fā)生磷酸化修飾。構建IκB-α磷酸化位點的抑制性突變從而抑制其磷酸化，其并未改變熱應激恢復期12 h p65磷酸化水平，也未改變p65的核轉位。熱打擊恢復期IκB-α同p65一起發(fā)生核轉位，同時我們使用小分子干擾RNA敲除p65，發(fā)

4、現(xiàn)在熱應激恢復期(2、6、12 h) IκB-α表達水平也發(fā)生降低，使用免疫共沉淀，發(fā)現(xiàn)正常及熱應激情況下IκB-α同p65均未發(fā)生解離，在熱應激時一齊轉入到核內共同調控基因表達，同時使用LPS刺激內皮細胞作為陽性參照，使用LPS刺激后IκB-α可與p65發(fā)生解離。
　　2.NF-κBp65及HSP27蛋白在所建立的熱應激內皮細胞模型中產生相互作用共同介導抗凋亡功能
　　使用NF-κB活化抑制劑BAY11-7082，或使用p

5、65-siRNA降低細胞p65蛋白的表達，熱打擊抑制劑預處理的細胞及p65-siRNA轉染的細胞。結果顯示使用抑制劑BAY11-7082或p65-siRNA明顯增加了熱打擊誘導的細胞凋亡，同時也增加了熱打擊誘導Caspase-3的活化。分別使用小分子干擾RNA降低HSP27表達及腺病毒過表達HSP27，給予43℃，90 min熱應激后恢復期12h流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，HSP27siRNA處理的細胞凋亡數(shù)目明顯增加，Caspase-

6、3的活化程度增加，Ad-HSP27預處理的細胞凋亡數(shù)目顯著降低，Caspase-3的活化程度也發(fā)生降低。這一結果說明了NF-κB和HSP27在熱應激致內皮細胞凋亡中起著抗凋亡的作用。
　　為進一步研究兩者關系，使用熒光顯微鏡觀察正常及熱應激情況下p65及HSP27在細胞內的分布情況，結果顯示正常情況下p65及HSP27都處于細胞漿分布，當給予43℃，90min熱應激恢復期12 h p65及HSP27主要分布在細胞核中。給予NF-κ

7、B活化抑制劑BAY11-7082預處理細胞，熱應激恢復期12h，BAY11-7082預處理組細胞p65核轉位明顯減少，同時HSP27在核內的累積也發(fā)生減低。故推測p65與HSP27之間可能存在相互作用，使用免疫共沉淀，發(fā)現(xiàn)在正常情況下，p65與HSP27存在連接，給予熱應激后兩者產生相互作用共同轉移到核內。使用小分子干擾RNA降低HSP27的表達明顯降低NF-κB p65的DNA轉錄活性，使用腺病毒過表達HSP27并未對NF-κB p6

8、5的DNA連接活性產生明顯影響，其可能與熱打擊本身可使HSP27表達升高，故熱應激后HSP27與p65作用位點已經飽和，故給予過表達并不能得出顯著結果。
　　進一步分析了NF-κB活化是否對HSF-1表達及活化產生影響從而對HSP27的表達起著間接作用。人臍靜脈內皮細胞給予43℃熱應激，Westernblotting檢測其熱應激過程中及其恢復期(15，30，60 min，R2，R6，R12 h) HSF1表達及磷酸化情況，同時提取

9、胞漿胞核蛋白Western blotting檢測熱應激恢復期(0、2、6、12 h) HSF1的核轉位情況。結果顯示熱應激早期15 min HSF1即已發(fā)生磷酸化，持續(xù)至恢復期6h，直至恢復期12h恢復至基礎水平，而HSF1表達水平并未升高反而發(fā)生降低，其分子量較正常升高，正常情況下HSF1在胞漿內呈單體狀態(tài)，給予熱應激后單體匯合形成三聚體，轉移到核內調控熱休克蛋白的轉錄，故熱應激后HSF1分子量較正常大，故在Western blott

10、ing圖中條帶位置顯示較高。給予熱應激后，HSF1可發(fā)生核轉位，恢復期0-2 h較為顯著，恢復期6-12hHSF1在核內的累積發(fā)生明顯下調。給予HSF1 siRNA降低HSF1表達及Ad-HSF1對HSF1過表達，Western blotting驗證其轉染效果及HSP27表達情況，在正常及熱應激情況下，HSF1均可對HSP27表達起調控作用。我們使用p65siRNA檢測其在熱應激情況下對HSF1核轉位及磷酸化的影響，結果顯示p65siR

11、NA處理細胞在熱應激恢復期6h并不影響HSF1的核轉位，同時p65siRNA處理的細胞在熱應激恢復期(2、6、12h)對HSF1的磷酸化水平也未產生明顯作用。
　　使用CHIP檢測試劑盒檢測NF-κBp65在HSP27啟動子區(qū)域是否存在結合位點，同時使用HSF1作為陽性參照來驗證整個CHIP系統(tǒng)是否有效。結果顯示HSF1在正常及熱應激情況下在HSP27啟動子區(qū)域都存在結合位點并對HSP27表達起調控作用，而NF-κBp65在HSP

12、27啟動子區(qū)域并未發(fā)現(xiàn)結合，但我們使用RNApolII文獻中報道其含有NF-κBp65的轉錄結合位點，發(fā)現(xiàn)其與HSP27啟動子結合增多，我們將NF-κBp65敲除后，發(fā)現(xiàn)RNA polII對HSP27啟動子結合明顯降低，從而從側面可得出NF-κBp65對HSP27在轉錄水平上可能起著調控作用。
　　3.NF-κB p65通過抑制熱應激致ROS在內皮細胞內累積，從而抑制下游MAPKs家族活化，最終起著抗凋亡作用。
　　提取熱應

13、激不同時間及熱應激90min后不同復溫時間點(0、2、4、6、12、24 h)和37℃對照組的HUVEC細胞總蛋白，Western blot方法分析MAPK家族活化情況;結果表明熱應激早期ERK、p38在熱應激15 min即可發(fā)生磷酸化，JNK在熱應激60 min發(fā)生磷酸化，在熱應激恢復期MAPKs家族磷酸化被快速誘導，熱應激恢復期4h仍維持在高水平，6h開始降低至基線水平，我們給予NF-κB活化抑制劑BAY11-7082及SN50預處

14、理細胞，熱應激恢復期6h時間點提取蛋白MAPKs家族活化，結果顯示給予抑制劑處理組MAPKs活化時間延長且活化強度增加，同時我們使用p65siRNA處理細胞檢測熱應激恢復期(2、6、12 h) MAPKs家族活化情況，結果表明p65siRNA處理組細胞MAPKs家族活化強度較NCsiRNA處理組增加。故NF-κB活化可介導MAPKs的強度增加及時間延長。
　　同時使用ROS清除劑APO及NAC預處理細胞檢測熱應激恢復期12h內皮細

15、胞凋亡情況，結果表明經APO及NAC預處理的細胞凋亡明顯降低，經APO預處理的細胞其Caspase-3活性明顯降低。使用ERK活化抑制劑PD98059、JNK抑制劑SP600125及p38活化抑制劑SB203580預處理細胞，Western blot方法驗證抑制劑效果，流式細胞術檢測細胞凋亡情況，SP600125及SB203580預處理細胞后其凋亡數(shù)目較DMSO對照組明顯降低，而PD98059預處理細胞組較DMSO對照組凋亡數(shù)目明顯增多

16、。以上結果表明熱應激使ROS在胞內過度累積從而導致凋亡發(fā)生，p38及JNK在熱打擊內皮細胞模型中起著促凋亡作用，ERK起著抗凋亡的作用。
　　結論：
　　1.熱應激可使NF-κB發(fā)生活化，其活化的機制為非經典途徑，其不伴有IκB-α的解離與降解，而是與p65一起轉入核內調控基因的轉錄。NF-κB的活化可能與其自身的熱敏性有關。
　　2.NF-κBp65及HSP27蛋白在所建立的熱應激內皮細胞模型中起著抗凋亡的作用。在正

17、常情況下NF-κB p65與HSP27在胞漿內分布并存在連接，在給予熱刺激后兩者一起轉入核內，熱應激致HSP27表達增加及核轉位其可使NF-κB p65維持其轉錄活性，同時NF-κB p65對HSP27可能存在轉錄調節(jié)作用。
　　3.NF-κB p65作為上游抑制熱應激致ROS在內皮細胞內累積，從而抑制下游MAPKs家族活化，最終起著抗凋亡的作用，但這種作用并不完全;熱應激使ROS在胞內過度累積從而導致凋亡發(fā)生，p38及JNK在熱