番茄紅素對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注損傷過(guò)程中凋亡和自噬的作用.pdf

1、目的:
　　探討番茄紅素對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注損傷過(guò)程中凋亡和自噬的作用。
　　方法：
　　分組:采用80只SPF級(jí)SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組，肝缺血再灌注組、番茄紅素治療組，番茄紅素+3-ma抑制組，每組20只。
　　建立大鼠肝臟部分缺血再灌注模型:通過(guò)大鼠腹腔內(nèi)注射2％戊巴比妥鈉麻醉(0.2ml/100g)進(jìn)行麻醉。取腹部正中縱行切口入腹，充分暴露腹腔內(nèi)臟器后，游離出第一肝門(mén)。使用無(wú)損顯微血管夾夾閉肝左、中葉脈

2、管的共干40min，使得肝左葉及肝中葉缺血，以實(shí)現(xiàn)70％的肝臟組織缺血。腹壁切口覆蓋生理鹽水紗布，達(dá)到預(yù)定缺血時(shí)間后松開(kāi)血管夾，隨后關(guān)腹。
　　樣本的采集和觀察指標(biāo)的測(cè)定:分別在缺血再灌注后1h、6h、12h、24h，予以取材檢測(cè)各項(xiàng)生化指標(biāo)。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠血清中谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，運(yùn)用雙抗體夾心ELISA法定量測(cè)定大鼠血清檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞炎性因子TNF-α，IL-6，Western免疫印跡

3、方法檢測(cè)肝臟組織中Beclin1，bax;通過(guò)蘇木精-尹紅(HE)染色觀察各組肝臟組織病理學(xué)改變。兩組計(jì)量資料間比較用T檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料間比較行卡方檢驗(yàn)。P值＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，所有統(tǒng)計(jì)分析均使用正版SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件完成。
　　結(jié)果：
　　1.血清ALT和AST水平的變化:與假手術(shù)組比較缺血再灌注組的血清中ALT和AST水平顯著升高(P＜0.05)，其在再灌注6h后達(dá)到頂峰，然后逐漸下降，再灌注12、24h

4、時(shí)血清ALT和AST水平逐漸下降。番茄紅素治療組與缺血再灌注組比較，番茄紅素+3-ma抑制組和番茄紅素治療組血血清ALT和AST水平相對(duì)升高(P＜0.05)。
　　2.血清中TNF-α，IL-6炎性因子的水平變化:在肝臟缺血再灌注組大鼠血清中顯著升高，于再灌注后6h達(dá)到頂峰，而后在12h，24h逐漸下降，治療組顯著低于缺血再灌注組，且再灌注后6h有顯著差異(P＜0.01)。而抑制組中TNF-α，IL-6在各時(shí)段均高于治療組，于再灌

5、注后6h有顯著差異(P＜0.01)
　　3.肝臟細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)水平的變化:肝臟凋亡相關(guān)蛋白bax的表達(dá)顯示，肝臟缺血再灌注組大鼠再灌注后bax的表達(dá)水平上升，而番茄紅素治療組肝臟bax的表達(dá)相比降低，僅再灌注1h時(shí)兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而抑制組與治療組相比降低了bax的表達(dá)，僅再灌注1h時(shí)兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.肝臟細(xì)胞自噬蛋白表達(dá)水平的變化，通過(guò)免疫印跡檢測(cè)肝臟自噬相關(guān)蛋白Beclin1、蛋白的表達(dá)顯示，Beclin

6、1在再灌注后6h時(shí)表達(dá)達(dá)到峰值，在12h和24h逐漸降低，番茄紅素治療組與缺血再灌注對(duì)照組相比增加了Beclin1的表達(dá)，而加入自噬抑制劑3-MA，與治療組相比抑制了Beclin1表達(dá)，顯示番茄紅素促進(jìn)肝臟缺血再灌注肝細(xì)胞Beclin1表達(dá)水平，促進(jìn)了自噬。
　　5.肝組織HE染色觀察:假手術(shù)組肝臟細(xì)胞形態(tài)正常，肝小葉、中央靜脈、匯管區(qū)結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索排列整齊。肝臟缺血再灌注模型對(duì)照組大鼠與番茄紅素治療組各時(shí)間點(diǎn)相比，肝組織紋理

7、不清，出現(xiàn)各種程度的水腫、壞死，以再灌注后6h時(shí)間點(diǎn)差異最為顯著，肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性和壞死，胞核固縮并深染，而番茄紅素各治療組肝臟組織病理形態(tài)學(xué)明顯改善。
　　結(jié)論：
　　發(fā)現(xiàn)番茄紅素預(yù)處理可以通過(guò)提高大鼠缺血再灌注肝臟自噬水平，降低血清ALT/AST水平并減輕炎癥反應(yīng)以及減少肝細(xì)胞凋亡從而起到保護(hù)缺血再灌肝損傷。進(jìn)一步通過(guò)加入自噬阻斷劑3-甲基腺嘌(3-MA)，發(fā)現(xiàn)削弱了番茄紅素這種保護(hù)作用。在肝臟缺血再灌注損傷中，說(shuō)明自