黔產(chǎn)莪術(shù)提取工藝的研究及莪術(shù)油對直腸癌SW1463細(xì)胞株分泌相關(guān)因子的影響.pdf

1、目的：優(yōu)選黔產(chǎn)莪術(shù)所含揮發(fā)油和姜黃素的最佳提取工藝；探討黔產(chǎn)莪術(shù)揮發(fā)油對直腸癌SW1463株分泌相關(guān)因子的影響。
　　方法:
　　1.水蒸氣蒸餾法提取莪術(shù)所含揮發(fā)油，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇提取時(shí)間、溶劑倍數(shù)、浸泡時(shí)間、和藥材粒度為四因素，采用L9（34）正交表設(shè)計(jì)提取工藝，以提取揮發(fā)油的體積為指標(biāo)；根據(jù)藥典的揮發(fā)油含量測定方法采用高效液相色譜法（HPLC）測定黔產(chǎn)莪術(shù)油中的吉馬酮和呋喃二烯含量；
　　2.乙醇法提取去

2、油莪術(shù)中的姜黃素含量，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇乙醇濃度和用量、提取次數(shù)和時(shí)間四因素,采用L9（34）正交表設(shè)計(jì)提取工藝，提取姜黃素浸膏；根據(jù)藥典的姜黃素含量測定法，采用HPLC測定浸膏中的姜黃素含量，選擇最佳提取工藝。
　　3.體外培養(yǎng)直腸癌SW1463細(xì)胞，采用MTT法篩選黔產(chǎn)莪術(shù)油對SW1463細(xì)胞的有效藥物濃度，并計(jì)算半數(shù)抑制率IC50，根據(jù)IC50設(shè)定藥物濃度80，120，160，200μg.mL-1的劑量組，采用倒置顯微

3、鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，Giemsa染色法觀察莪術(shù)油對SW1463細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響；
　　4.采用 ELISA法檢測培養(yǎng)細(xì)胞上清中IL-2,IL-10,TGF-β1免疫因子的表達(dá)；采用Western Blot法檢測培養(yǎng)細(xì)胞的Fas,FasL,TLR2,TLR4,C-Raf,Caspase-3蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.黔產(chǎn)莪術(shù)鮮品100g加適量蒸餾水提取揮發(fā)油的出油量為0.4～1.2mL，折成干品后的出油率為1.4

4、8％～4.44%(mL/g)。影響揮發(fā)油提取的最大因素是提取時(shí)間，最佳提取工藝是藥材粉碎粒徑0.2±0.1cm，加5倍量水浸泡6h，提取8h，揮發(fā)油收率為1.2mL；HPLC測定結(jié)果吉馬酮9.58%，呋喃二烯12.18%。
　　2.影響姜黃素提取的因素是乙醇濃度，最佳提取工藝是提取揮發(fā)油后的莪術(shù)藥渣加5倍量95%的乙醇，提取2次，每次2h。
　　3.MTT檢測發(fā)現(xiàn)莪術(shù)油對SW1463細(xì)胞有一定的增殖抑制作用，并呈現(xiàn)時(shí)間-劑量

5、依賴性，莪術(shù)油作用細(xì)胞24h的IC50為128.28±11.84（μg·mL-1）；藥物作用24h的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，隨著藥物濃度的增大，細(xì)胞數(shù)量逐漸變少；Giemsal染色細(xì)胞可見典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征。
　　4. IL-2、IL-10和TGF-β1的含量隨藥物濃度上升而表達(dá)減少，單因素方差分析，IL-2表達(dá)的組間差異有顯著性（F=21.02，*P﹤0.05），IL-10表達(dá)的組間差異有顯著性(F=23.11，P<0.01)；TG

6、F-β1表達(dá)的組間差異有顯著性（F=850.97,**P<0.01）；
　　5. Western Blot法檢測培養(yǎng)細(xì)胞中的蛋白表達(dá)。莪術(shù)油處理SW1463細(xì)胞24h后，與對照組比較，F(xiàn)asL蛋白表達(dá)上調(diào)（*P<0.05,**P<0.01），F(xiàn)as蛋白表達(dá)下調(diào)(*P<0.05)，TLR2蛋白(**P<0.01)和TLR4蛋白(*P<0.05)表達(dá)下調(diào)，TGF-β1和C-Raf蛋白表達(dá)下調(diào)(*P<0.05,**P<0.01）,Cas