秦艽轉(zhuǎn)基因根植株誘導(dǎo)及其龍膽苦苷合成能力的分析.pdf

1、秦艽(GentianamacrophyllaPall.)為龍膽科(Gentianaceae)多年生草本植物，是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥材，以根入藥，具有抗風(fēng)濕解熱鎮(zhèn)痛抑菌等作用。 轉(zhuǎn)基因根(transgenicroot，TGR)，也叫發(fā)狀根(hairyroot，HR)，是植物受傷部位經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌感染(Agrobateriumrhizogenes)后所誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種根狀器官。由于轉(zhuǎn)基因根不僅可以經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)再生出可能具有某種優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因

2、植株，也可以在液體懸浮培養(yǎng)條件些大量繁殖，并合成一些對(duì)人類(lèi)有用的次生代謝產(chǎn)物，所以被公認(rèn)為是一種有前途的生產(chǎn)有用次生代謝產(chǎn)物(包括藥用成分)的新途徑。由于近三分之一傳統(tǒng)藥材的藥用部位是根，所以轉(zhuǎn)基因根研究在傳統(tǒng)藥材生物藥生產(chǎn)中具有更重要的意義。 本研究利用本課題組張慧麗碩士?jī)赡昵敖⒌那剀崔D(zhuǎn)基因根，通過(guò)組織培養(yǎng)方法建立了相應(yīng)的植株再生體系，探討了不同激素濃度/組合對(duì)其植株再生能力的影響，分析再生植株形態(tài)學(xué)和龍膽苦苷合成能力。此外

3、，還研究了多種物理化學(xué)因素對(duì)秦艽轉(zhuǎn)基因根生物量和龍膽苦苷合成能力的影響。目的是探討通過(guò)植株誘導(dǎo)獲得一些高龍膽苦苷合成能力的新品系和通過(guò)液體懸浮培養(yǎng)大量合成龍膽苦苷及其他有用次生代謝產(chǎn)物的可能性。主要研究結(jié)果如下： (1)在含1.0㎎/l2，4-D+0.5㎎/l6-BA的MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)21天后，100％的TGR外植體均可誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織。轉(zhuǎn)移到無(wú)激素的MS固體培養(yǎng)基中14天后，高達(dá)94％的胚性愈傷組織可以產(chǎn)生1-12個(gè)芽

4、點(diǎn)。經(jīng)過(guò)兩周的培養(yǎng)后，這些芽點(diǎn)可以發(fā)育成與種子苗一樣的小苗。在室外，50％的再生植株可以存活。大部分在室外生長(zhǎng)的再生植株與野生型植株相比，它們的葉子呈深綠色、葉面皺縮的橢圓形，氣孔也較為小而密集；再生植株的葉子和根的重量分別比野生型植株的增加6倍和2倍。PCR分析證明這些再生植株的基因組內(nèi)仍然保留Ri質(zhì)粒中的rolC基因。HPLC分析結(jié)果表明再生植株的根中龍膽苦苷含量要比野生型高74.2％，但是葉子中的含量則要低12.9％。 (

5、2)分析不同理化因?qū)D(zhuǎn)基因根生物量和龍膽苦苷合成的影響發(fā)現(xiàn)：(a)光照可以明顯提高秦艽轉(zhuǎn)基因根生物量和龍膽苦苷的含量。(b)其生物量累積隨蔗糖濃度的升高呈先升后降的趨勢(shì)，在30g/l時(shí)達(dá)到最大值；其龍膽苦苷單位含量則隨蔗糖濃度的升高而總體呈上升趨勢(shì)，在40和50g/l的時(shí)候達(dá)到最大。(c)低的銨/硝態(tài)氮比有利于其生長(zhǎng)，隨著銨/硝態(tài)氮比率的升高，其生物量累積隨之減少。當(dāng)培養(yǎng)基中只有銨鹽的時(shí)候則完全抑制了它的生長(zhǎng)，而其龍膽苦苷單位含量則隨之

6、升高。當(dāng)銨鹽由硫酸銨替換為硝酸銨(比率為0.825g/l：1.775g/l)時(shí)，最利于其生長(zhǎng)，即其生物量累積和龍膽苦苷單位含量在此時(shí)都達(dá)到最高值。(d)在甘氨酸濃度為0時(shí)，秦艽轉(zhuǎn)基因根也有一定量的生物量累積和龍膽苦苷的合成，但太高和太低的甘氨酸濃度都不利于其生物量的積累，當(dāng)濃度為1.0㎎/l時(shí)，生物量累積達(dá)到最大值；在甘氨酸濃度為0.5㎎/l時(shí)，其龍膽苦苷單位含量達(dá)到最大。(e)由于秦艽轉(zhuǎn)基因根合成龍膽苦苷的總量受生物量和單位含量的共同