龍膽苦苷鎮(zhèn)痛與抗抑郁的中樞作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　臨床研究強(qiáng)烈提示痛和抑郁具有高度的共患性，患有其中一種疾病后，罹患另外一種疾病的概率就會(huì)增加。慢性痛與抑郁的并發(fā)不僅會(huì)降低治療效果，增加治療難度，而且嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和治療信心。近年來，慢性痛和抑郁錯(cuò)綜復(fù)雜的相互作用備受矚目，被稱為“痛-抑郁綜合征”或者“痛-抑郁二聯(lián)征”。目前僅有兩個(gè)上市藥物既被批準(zhǔn)用于抑郁癥的治療，同時(shí)也有外周神經(jīng)痛、纖維肌痛的適應(yīng)癥，痛-抑郁綜合征的藥物治療機(jī)遇與挑戰(zhàn)并存，是臨床前藥物研

2、究亟需解決的問題。
　　NMDA作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的興奮性受體，在情緒調(diào)節(jié)和痛覺的傳遞中發(fā)揮重要的作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明NMDA受體拮抗劑不但能夠緩解纖維肌痛的疼痛癥狀，而且能夠快速、有效的緩解難治性抑郁患者的癥狀。NMDA受體有望成為痛-抑郁綜合征藥物治療的靶點(diǎn)。然而，現(xiàn)有NMDA受體拮抗劑靜脈注射的給藥途徑以及擬精神病的副作用限制了其臨床應(yīng)用，因此亟需針對(duì)該靶點(diǎn)尋找安全有效的藥物。
　　單胺遞質(zhì)學(xué)說是抑郁癥發(fā)病機(jī)

3、理的主流學(xué)說，然而基于單胺遞質(zhì)學(xué)說的抗抑郁藥只能緩解50％的抑郁癥狀；即便癥狀被控制，也有60%的患者有復(fù)發(fā)傾向。事實(shí)上，科學(xué)家探索抑郁的發(fā)病機(jī)制，尋找新的藥物治療靶點(diǎn)的腳步從未停止。
　　近年來，抑郁的炎癥學(xué)說得到了多方面證據(jù)的支持。首先，抑郁癥患者血漿和腦脊液中IL-6、TNF-α等炎性因子的水平顯著升高；其次，炎性因子或者炎性因子的誘導(dǎo)劑可以使人或者動(dòng)物出現(xiàn)抑郁樣癥狀；再次，減弱炎癥反應(yīng)可以緩解抑郁癥狀。由此可見，炎癥在抑郁

4、的病理過程中發(fā)揮著重要的作用，炎癥通路也可能成為抑郁癥治療的新靶點(diǎn)。
　　炎性因子激活色氨酸降解途徑，導(dǎo)致神經(jīng)毒性物質(zhì)及NMDA受體激動(dòng)劑喹啉酸的蓄積，是炎癥導(dǎo)致抑郁的主要病理學(xué)機(jī)制。由此可見，抗炎與NMDA受體拮抗雙靶點(diǎn)的藥物有望為抑郁癥的藥物治療提供新的策略。
　　目的與意義：
　　本課題研究了龍膽苦苷（gentiopicroside，Gent）對(duì)于利血平誘導(dǎo)的痛-抑郁綜合征、LPS-誘導(dǎo)的抑郁以及LPS誘導(dǎo)的中樞

5、神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的作用及作用機(jī)制，評(píng)價(jià)了Gent的藥代動(dòng)力學(xué)特征和血腦屏障的通透性，首次報(bào)道了Gent對(duì)抑郁與中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的潛在治療作用，填補(bǔ)了Gent中樞藥理作用研究的空白，為Gent及龍膽屬藥物的開發(fā)提供了依據(jù)，也為探索痛-抑郁綜合征和抑郁的藥物治療靶點(diǎn)做了有益的嘗試。
　　研究方法：
　　第一部分Gent對(duì)利血平誘導(dǎo)的痛-抑郁綜合征模型小鼠的作用與機(jī)制
　　建立利血平誘導(dǎo)的痛-抑郁綜合征小鼠模型，采用熱刺激痛和機(jī)

6、械痛評(píng)價(jià)Gent對(duì)痛覺敏感性的影響，采用強(qiáng)迫游泳、懸尾實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)考察Gent對(duì)抑郁樣行為的影響；采用HPLC檢測(cè)基底杏仁核腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的變化、試劑盒檢測(cè)氧化應(yīng)激水平的變化，Western blot檢測(cè)谷氨酸受體和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，闡明Gent緩解利血平誘導(dǎo)痛-抑郁綜合征的作用機(jī)制，并用GluN2B受體阻斷劑進(jìn)行驗(yàn)證。
　　第二部分Gent對(duì)LPS誘導(dǎo)的抑郁癥模型小鼠的作用與機(jī)制
　　建立LPS誘導(dǎo)的小鼠抑郁模

7、型，采用強(qiáng)迫游泳、懸尾實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)考察Gent對(duì)抑郁樣行為的影響；ELISA試劑盒檢測(cè)血漿和腦組織中炎性因子的水平；LC-MS/MS檢測(cè)腦組織中色氨酸及其代謝產(chǎn)物的變化，用犬尿氨酸/色氨酸表示IDO的酶活性；Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)，闡明Gent緩解LPS誘導(dǎo)小鼠抑郁樣行為的作用機(jī)制。
　　第三部分 Gent對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的作用與機(jī)制
　　建立原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞和原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)體

8、系；采用MTT、ELISA、Western blot以及免疫熒光考察Gent對(duì)LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響，以及激活星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用；采用在體實(shí)驗(yàn)考察Gent對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的作用。
　　第四部分 Gent在小鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)和血腦屏障的通透性研究
　　建立小鼠血漿、腦組織和腦脊液中Gent含量測(cè)定的LC-MS/MS方法并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證；采用DAS2.0軟件對(duì)小鼠靜脈注射Gent后的體

9、內(nèi)過程進(jìn)行模擬，計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)；通過比較腦組織和腦脊液中Gent的藥物濃度表征其血腦屏障通透性。
　　研究結(jié)果：
　　第一部分
　　1. Gent可以緩解利血平誘導(dǎo)痛-抑郁綜合征模型小鼠對(duì)熱刺痛和機(jī)械痛的痛敏，改善抑郁樣行為，且具有劑量依賴性；
　　2. Gent可以提高利血平誘導(dǎo)痛-抑郁綜合征模型小鼠BLA中單胺遞質(zhì)的水平，降低氧化應(yīng)激，且具有劑量依賴性；
　　3. Gent可以劑量依賴性地下調(diào)利血平

10、誘導(dǎo)的BLA腦組織中凋亡相關(guān)蛋白和GluN2B的表達(dá)，而對(duì)GluN2A和GluA1的表達(dá)無影響；
　　4. GluN2B受體特異性拮抗劑Ro25-6981也能夠逆轉(zhuǎn)利血平誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和BLA腦組織凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　第二部分
　　1.小鼠腹腔注射LPS造模24 h后病態(tài)行為消失，出現(xiàn)抑郁樣行為，Gent可以緩解LPS誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為；
　　2.小鼠腹腔注射LPS造模24 h后，血漿中TNF-α和IL-

11、1β與正常組無顯著差異；但腦組織中仍有差異，Gent可以降低小鼠BLA和PFC腦組織中TNF-α和IL-1β水平；
　　3. Gent可以下調(diào)LPS誘導(dǎo)的腦組織中色氨酸代謝途徑的激活；
　　4. Gent可以下調(diào)LPS誘導(dǎo)的小鼠PFC腦組織GluN2B的表達(dá)。
　　第三部分
　　1. Gent可以抑制LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，減少炎性因子的釋放，緩解激活星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元的損傷；
　　2. Gent

12、可以通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的MAPK途徑和NF-κB途徑的激活，下調(diào)iNOS和COX-2的表達(dá)；
　　3. Gent可以下調(diào)LPS誘導(dǎo)的小鼠腦組織中iNOS和COX-2的表達(dá)，而且其作用與腦區(qū)密切相關(guān)。
　　第四部分
　　1.小鼠靜脈注射Gent的體內(nèi)過程符合一室模型，初始血藥濃度C0為57.4μg/mL；半衰期t1/2為69.3 min；清除率Cl為0.043 L/min/kg；藥-時(shí)曲線下面積AUC0-∞

13、為1995.36 mg/L*min；
　　2. Gent可以通過血腦屏障，在腦組織中代謝消除相對(duì)較慢，但無蓄積性。
　　研究結(jié)論：
　　1. Gent可以緩解利血平誘導(dǎo)的小鼠痛-抑郁綜合征，其作用機(jī)制與Gent抗氧化、下調(diào)BLA腦組織中GluN2B的表達(dá)密切相關(guān)；
　　2. Gent可以通過抗炎和下調(diào)GluN2B表達(dá)的雙重作用緩解炎癥導(dǎo)致的抑郁；
　　3. Gent可以抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的MAPK