Notch-1與NF-κB協(xié)同調(diào)控腫瘤細(xì)胞遷移的交互作用機(jī)制研究.pdf

1、癌癥是威脅人類生命最嚴(yán)重的疾病之一，據(jù)美國癌癥協(xié)會2015年最新的年度統(tǒng)計數(shù)據(jù)報告顯示肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和乳腺癌仍然是癌癥死亡的最常見原因。世界癌癥報告估計2012年我國癌癥發(fā)病人數(shù)約360萬，癌癥死亡人數(shù)約為220萬，約占全球癌癥死亡人數(shù)的四分之一，而90％的腫瘤病人死于癌癥的轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移是腫瘤惡性行為的特征性表現(xiàn)，也是臨床治療失敗的主要原因，控制轉(zhuǎn)移成功與否是決定癌癥患者生存與否的關(guān)鍵。但腫瘤是多基因控制的復(fù)雜疾病，深入研究癌癥發(fā)

2、生與轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，對未來的靶向治療癌癥具有非常重要的作用。
　　Notch信號通路高度保守，最先發(fā)現(xiàn)是在胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化方面起作用，隨后的大量研究發(fā)現(xiàn)異?；罨腘otch信號通路與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。Notch-1及其配體的過表達(dá)與乳腺癌的預(yù)后率密切相關(guān)。然而，Notch-1信號通路在乳腺癌中的作用機(jī)制并不清楚。本研究以高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231為研究對象，首先分析Notch家族受體Notch-1對乳腺癌細(xì)胞惡

3、性行為的作用，證實了Notch-1活化促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長、黏附、遷移和侵襲等惡性行為。然后闡明了Notch-1促進(jìn)細(xì)胞遷移的機(jī)制。研究內(nèi)容如下：
　　1.細(xì)胞模型的構(gòu)建：通過反轉(zhuǎn)錄PCR從人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251細(xì)胞中獲取人Notch-1胞內(nèi)段（NICD）的序列全長cDNA，并克隆到載體pcDNA3.1（+）中。通過瞬時轉(zhuǎn)染進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞中，經(jīng)Real-timePCR和Westernblot鑒定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中NICD成

4、功過表達(dá)。Notch-1shRNA經(jīng)瞬時轉(zhuǎn)染后也有效降低Notch-1的表達(dá)。
　　2.Notch-1對乳腺癌細(xì)胞惡性行為的作用：（1）通過CCK-8、平板克隆以及軟瓊脂糖克隆形成實驗分析細(xì)胞增殖能力證明過表達(dá)NICD能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，而沉默Notch-1則會抑制細(xì)胞增殖。（2）通過流式細(xì)胞術(shù)和CalceinAM/PI雙染發(fā)現(xiàn)NICD過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞周期大量進(jìn)入S期并抑制細(xì)胞凋亡，沉默Notch-1則將細(xì)胞周期阻滯才G0/G1期且促

5、進(jìn)細(xì)胞凋亡。（3）通過細(xì)胞黏附分析實驗、劃痕實驗以及Transwell小室實驗證實NICD過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的黏附、遷移和侵襲。相反，沉默Notch-1則抑制細(xì)胞的黏附、遷移和侵襲能力。以上實驗表明Notch-1活化對細(xì)胞的惡性行為有促進(jìn)作用。
　　3.Notch-1促進(jìn)MMP-2、MMP-9、VEGF的表達(dá)：Real-timePCR和明膠酶譜實驗證實Notch-1活化促進(jìn)MMP-2、MMP-9和VEGF的表達(dá)，并增強(qiáng)MMP-9的活性

6、。沉默Notch-1則抑制MMP-2、MMP-9和VEGF的表達(dá)，且MMP-9的活性也隨之降低。
　　4.Notch-1活化NF-κB信號通路：（1）通過免疫熒光、westernblot、EMSA、雙熒光素酶報告基因檢測證明Notch-1活化導(dǎo)致IκBα降解，促進(jìn)NF-κB的p65亞基入核轉(zhuǎn)移，并增強(qiáng)NF-κB與DNA的結(jié)合活性和轉(zhuǎn)錄活性。沉默Notch-1抑制IκBα降解，導(dǎo)致p65入核轉(zhuǎn)移減少，NF-κB的DNA結(jié)合活性和轉(zhuǎn)錄

7、活性都降低。（2）Westernblot分析證明Notch-1活化促進(jìn)NF-κB下游靶基因CyclinD1、Bcl-xL、Survivin的表達(dá)。說明Notch-1活化能夠激活NF-κB信號通路。
　　5.Notch-1促進(jìn)細(xì)胞侵襲依賴于NF-κB的活性：（1）LPS刺激促進(jìn)細(xì)胞侵襲，并拮抗Notch-1沉默導(dǎo)致的細(xì)胞侵襲能力降低。NF-κB抑制劑處理抑制細(xì)胞的侵襲能力，并阻斷NICD過表達(dá)引起的細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)。（2）抑制Not

8、ch-1活性，LPS處理仍能夠增加MMP-2、MMP-9和VEGF的表達(dá)。而抑制NF-κB，活化的Notch-1不能促進(jìn)MMP-2、MMP-9和VEGF的表達(dá)。以上結(jié)果說明Notch-1促進(jìn)細(xì)胞侵襲必須依賴于NF-κB活性。
　　6.Notch-1活化NF-κB的機(jī)制：（1）Westernblot分析證明Notch-1活化激活PI3K/AKT信號通路，而抑制PI3K磷酸化則Notch-1活化不能增強(qiáng)AKT的磷酸化水平。（2）Wes

9、ternblot和免疫熒光技術(shù)證明抑制AKT磷酸化，Notch-1活化不能誘導(dǎo)p65入核轉(zhuǎn)移。說明Notch-1通過PI3K/AKT途徑活化NF-κB。（3）活化Notch-1增強(qiáng)PP2A的磷酸化水平，抑制其活性。PP2A抑制劑OA（岡田酸）抑制PP2A活性后Notch-1沉默不能降低PI3K、AKT的磷酸化水平。免疫熒光染色和westernblot分析證實OA抑制PP2A活性后沉默Notch-1不能減少p65入核轉(zhuǎn)移。雙熒光素酶報告基

10、因檢測也證實了OA抑制PP2A活性增強(qiáng)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，且逆轉(zhuǎn)Notch-1沉默引起的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性降低。說明Notch-1通過PP2A調(diào)控了NF-κB的活性。
　　綜上所述，本論文通過分析Notch-1在乳腺癌生長和轉(zhuǎn)移方面的作用，明確了Notch-1活化會促進(jìn)細(xì)胞的生長、黏附、遷移和侵襲。闡明了Notch-1促進(jìn)細(xì)胞惡性行為的機(jī)制是調(diào)控PP2A活性而調(diào)節(jié)PI3K/AKT/NF-κB信號通路的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游與細(xì)胞周期