RhoC調(diào)控人滋養(yǎng)細胞遷移的機制及子癇前期患者臨床資料分析.pdf

1、目的：
　　子癇前期(preeclampsia，PE)/子癇（eclampsia）一直是嚴重影響孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒健康的產(chǎn)科重癥，其發(fā)病率和致死率均較高，但其發(fā)病原因尚不明確，因此臨床治療多以“對癥治療”和“適時終止妊娠”為主要手段，效果不佳。本研究在細胞實驗部分著重對RhoC/ROCK調(diào)控人滋養(yǎng)細胞遷移相關的微管骨架和黏著斑結構方面的可能機制進行初步探討。并在臨床資料分析部分還回顧了PE/子癇患者產(chǎn)前或產(chǎn)后1周內(nèi)的腎活檢的病理學特征

2、和母兒情況。
　　方法：
　　在細胞學實驗部分，本研究以人滋養(yǎng)細胞JEG-3細胞系為主要研究平臺，分別構建RhoC蛋白的高表達和低表達慢病毒載體，并用相應的慢病毒包裝感染JEG-3細胞，在體外實現(xiàn)對人滋養(yǎng)細胞RhoC基因的調(diào)控;然后分別利用Transwell小室遷移實驗和劃痕實驗檢測不同RhoC表達水平的滋養(yǎng)細胞固有遷移和水平遷移的能力變化，利用Transwell小室結合基質(zhì)膠的侵襲實驗檢測滋養(yǎng)細胞中不同RhoC蛋白表達水平

3、對細胞侵襲功能的影響，利用CCK-8細胞增殖實驗檢測在正常培養(yǎng)和低血清培養(yǎng)條件下滋養(yǎng)細胞中RhoC表達變化對于細胞增殖的作用;再采用免疫印跡法檢測RhoC高表達和低表達細胞中RhoC下游靶分子ROCKⅠ和ROCKⅡ蛋白的表達，以及調(diào)節(jié)微管聚合的MAP4蛋白的表達差異;為了分析不同RhoC表達水平的滋養(yǎng)細胞中微管的聚合和解聚水平，我們先將細胞中聚合狀態(tài)和游離狀態(tài)的微管蛋白進行分離，再用的免疫印跡分別進行蛋白水平檢測，同時還在激光共聚焦掃描

4、顯微鏡下觀察細胞微管結構的變化情況;最后運用免疫印跡法檢測不同RhoC表達水平的JEG-3細胞中黏著斑蛋白的表達情況，并用激光共聚焦顯微鏡掃描細胞中黏著斑結構的排列特征。
　　在PE患者臨床資料分析的第一部分中，本研究首先選取2007年1月至2013年12月間在第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院產(chǎn)科住院分娩的孕婦共173人，其中輕度子癇前期(mild preeclampsia，mPE)患者53人，重度子癇前期(severe preeclamps

5、ia，sPE)患者42人，正常對照組孕婦79人。重點排除了既往有腎病史、胰島素依賴型糖尿病、需要甾體激素治療的哮喘、慢性肝炎（無論是否有肝功能異常）、嚴重的外傷史、服用抗凝藥物史、口服避孕藥物史、吸煙史、特發(fā)性血小板減少性紫癜、HELLP綜合征、妊娠期血小板減少癥或任何類型的血液系統(tǒng)疾病的患者。分別收集每名患者早孕期和晚孕期凝血功能和血小板參數(shù)的檢測結果，再對其進行對比和統(tǒng)計學分析。不同組別之間的正態(tài)分布變量差異的顯著性采用單因素方差分

6、析多重比較，對于非參數(shù)變量則采用Kruskal-Wallis法檢驗并進行post-hoc分析。比較同一患者不同孕期的相同參數(shù)使用配對檢驗，其中正態(tài)分布變量采用Fisher's LSD法，而非參變量采用Wilcoxon法。最后采用使用受試者工作特征(receiver-operating characteristic，ROC)曲線評估每一項參數(shù)預測PE發(fā)病和嚴重程度的實際效能，并利用二進制回歸分析評價篩選出的指標對PE的預測價值。
　

7、　在PE患者臨床資料分析的第二部分中，本研究回顧了從2007年1月至2012年1月間，因病情進展或診治需要于妊娠期或分娩后7日內(nèi)在第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院腎臟內(nèi)科進行超聲引導下的細針經(jīng)皮腎穿刺活檢的sPE/子癇患者，共8例。所有患者均排除了糖尿病史、系統(tǒng)性紅斑狼瘡病史、慢性高血壓病史、腎病病史或近期出現(xiàn)的尿路感染。對這些患者的臨床特點、母兒結局、母體主要血清學指標，并重點觀察和分析了其腎臟病理切片和免疫熒光特征。
　　結果：
　

8、?。ㄒ唬┘毎麑W實驗部分
　　1.本研究利用生物信息學技術、RNA干擾技術結合基因工程技術成功構建了RhoC高表達和RhoC干擾慢病毒載體，并利用這兩種慢病毒的包裝成功高效感染293T細胞模型和JEG-3滋養(yǎng)細胞，并鑒定和篩選出RhoC持續(xù)高表達和持續(xù)低表達的穩(wěn)定轉染JEG-3滋養(yǎng)細胞株，其RhoC蛋白表達水平分別顯著高于和低于空載體病毒感染組的滋養(yǎng)細胞和正常對照組滋養(yǎng)細胞。
　　2.在正常細胞培養(yǎng)的條件下，滋養(yǎng)細胞中RhoC

9、蛋白表達水平升高可顯著提高細胞的固有遷移、水平遷移、侵襲和增殖能力，而RhoC蛋白表達降低則可顯著抑制細胞的固有遷移、水平遷移、侵襲和增殖的能力;但在低血清培養(yǎng)條件下，滋養(yǎng)細胞中RhoC的表達水平并不會對細胞增殖造成顯著影響。
　　3.在滋養(yǎng)細胞中，RhoC下游的靶分子ROCKⅠ和ROCKⅡ的蛋白表達水平與RhoC蛋白表達高度一致，提示RhoC在細胞內(nèi)可能通過促進ROCKⅠ和ROCKⅡ分子的表達和作用而發(fā)揮生物學效應;而在滋養(yǎng)細胞

10、中，MAP4蛋白的表達與ROCKⅠ和ROCKⅡ的變化高度一致，提示RhoC可能通過ROCKⅠ和ROCKⅡ?qū)AP4的磷酸化而實現(xiàn)對細胞遷移的調(diào)控。
　　4.在滋養(yǎng)細胞中，RhoC蛋白可以對微管的聚合狀態(tài)和游離狀態(tài)進行調(diào)節(jié)，RhoC表達升高后聚合狀態(tài)微管蛋白顯著增多而游離狀態(tài)微管蛋白顯著減少，微管的結構在形態(tài)學上聚合增強，排列有序;RhoC表達降低后胞內(nèi)游離狀態(tài)的微管蛋白水平上調(diào)而聚合狀態(tài)的微管蛋白水平下調(diào)，微管結構在形態(tài)學上趨于解

11、聚，排列紊亂。
　　5.在滋養(yǎng)細胞中，RhoC蛋白表達與黏著斑蛋白的水平變化相反，RhoC上調(diào)后黏著斑蛋白表達降低，在形態(tài)學上黏著斑的結構解離增強;RhoC下調(diào)后黏著斑蛋白表達升高，在形態(tài)學上黏著斑結構的重構增強。
　?。ǘ㏄E患者臨床資料分析一
　　1.正常孕婦晚孕期活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)、凝血酶原時間和凝血酶時間(thrombi

12、n time，TT)水平較早孕期降低，而纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）水平升高，表現(xiàn)出生理性的高凝狀態(tài);晚孕期血小板計數(shù)(platelet count，Pt Count)水平較早孕期下降而MPV升高，可能是由血小板聚集和消耗以及繼發(fā)性血小板再生所引起。
　　2.PE患者在孕晚期出現(xiàn)了超高凝的狀態(tài)，其微血管中微血栓的形成和纖維蛋白的大量產(chǎn)生及繼發(fā)性溶解導致血小板和FIB的大量消耗，PE特別是sPE患者孕晚期出現(xiàn)APTT和

13、TT延長以及D-二聚體和平均血小板體積(mean platelet volume，MPV)的升高，提示其體內(nèi)發(fā)生了內(nèi)源性和外源性凝血途徑的嚴重紊亂。
　　3.MPV是早期預測PE的理想指標（以MPV＞8.95fL為入選標準），也是預測PE嚴重程度的重要潛在標志（以MPV＞9.95fL為入選標準）。
　?。ㄈ㏄E患者臨床資料分析二
　　1.PE/子癇患者腎臟活檢常見的病理特征包括:內(nèi)皮增生、足細胞空泡形成、腎小球系膜細

14、胞增殖和腎小管管腔的蛋白管型;
　　2.補體成分(C4)和免疫球蛋白(IgM)的沉積，可能導致嚴重的腎損傷;
　　3.BUN/SCr比值有成為sPE標志物的潛力;
　　4.子癇可以發(fā)生于血壓稍高于正常范圍（135/93mmHg）的患者，在臨床工作中必須引起高度的重視;
　　5.妊娠期間的腎活檢僅推薦用于確診和改進治療策略，并應根據(jù)患者的一般條件，包括血壓和凝血功能等情況酌情實施。
　　結論:
　　(1

15、) RhoC對滋養(yǎng)細胞的固有遷移、水平遷移和侵襲能力具有調(diào)控作用，其主要機制是通過激活下游靶蛋白ROCKⅠ和ROCKⅡ來調(diào)節(jié)MAP4分子的表達，進而影響細胞微管骨架的聚合和黏著斑結構的重構。這些結果為深入闡明Rho亞家族蛋白調(diào)控滋養(yǎng)細胞遷移的細胞骨架相關機制奠定了一定的研究基礎，也為開發(fā)新的滋養(yǎng)細胞遷移調(diào)控靶點進而對PE的發(fā)生進行早期預防提供了初步的實驗依據(jù)。
　　(2)正常妊娠晚期孕婦凝血-纖溶系統(tǒng)處于生理性的高凝狀態(tài)，表現(xiàn)為血

16、小板數(shù)量的消耗和生成的激活;PE患者的內(nèi)源性和外源性凝血途徑均發(fā)生嚴重紊亂而出現(xiàn)超高凝的狀態(tài)，同時消耗了血小板和纖維蛋白原，造成患者多器官病變和出血傾向，導致PE發(fā)病或進一步加重病情;MPV可作為PE發(fā)病和嚴重程度的早期預測指標。這些結果為PE的凝血特點研究及早期預測研究奠定了初步的基礎。
　　(3)內(nèi)皮增生、足細胞空泡變性、腎小球系膜細胞增殖和腎小管腔的蛋白管型是PE/子癇患者腎活檢的主要病理表現(xiàn)，C4和IgM的沉積可能是PE患