香煙煙霧提取物中CYP2A13的新底物5-HMF的發(fā)現(xiàn)及毒性研究.pdf

1、在人類57種CYP450酶中，僅有十幾個(gè)酶負(fù)責(zé)外源化學(xué)物的代謝，這些代謝酶存在組織特異性，人細(xì)胞色素P4502A13(CYP2A13)是一種主要在呼吸系統(tǒng)中表達(dá)的肝外代謝酶。前期研究發(fā)現(xiàn)，CYP2A13高效代謝活化AFB1生成多種代謝產(chǎn)物，與DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合形成加合物，引發(fā)細(xì)胞毒性、炎癥、DNA損傷、腫瘤等毒效應(yīng)。
　　吸煙導(dǎo)致呼吸道損傷，而長期吸煙易高發(fā)肺癌，NNK和尼古丁是香煙煙霧中公認(rèn)的CYP2A13底

2、物，研究表明NNK可經(jīng)CYP2A13的代謝活化導(dǎo)致小鼠肺癌的發(fā)生。尼古丁是香煙煙霧抽提物(CSE)中含量最多的物質(zhì)，約占CSE總含量的1％。研究表明，尼古丁及其代謝產(chǎn)物介導(dǎo)的物質(zhì)毒性相對較低，但可能導(dǎo)致CYP2A13的急劇消耗，進(jìn)而抑制CYP2A13對香煙煙霧其他物質(zhì)的代謝活化。前期研究發(fā)現(xiàn)，去除尼古丁可導(dǎo)致CYP2A13介導(dǎo)的CSE毒性顯著增強(qiáng)，由于NNK在CSE中的含量很低，因此推測CSE中可能存在含量相對較高的CYP2A13新底物

3、。為此，本研究利用標(biāo)準(zhǔn)參比煙3R4F，采用經(jīng)高效液相色譜系統(tǒng)結(jié)合已經(jīng)建立的穩(wěn)定表達(dá)人CYP2A13的BEAS-2B細(xì)胞(B-2A13)，解析CSE中與CYP2A13代謝活化相關(guān)組分，并進(jìn)一步分離、純化和鑒定，試圖發(fā)現(xiàn)CYP2A13的新底物;然后利用體外代謝反應(yīng)進(jìn)一步確定與CYP2A13代謝相關(guān)的單體;再利用B-2A13和B-2A5細(xì)胞以及CYP2A5敲除小鼠(CYP2A5-/-)，系統(tǒng)闡明CYP2A13在代謝活化候選單體所致呼吸道損傷中

4、的作用，明確CYP2A13與候選CSE組分單體的關(guān)系。研究結(jié)果不僅可為吸煙所致呼吸系統(tǒng)損傷的機(jī)制研究提供新的研究策略，也可為控制吸煙并尋找切實(shí)可行的預(yù)防控制措施提供依據(jù)，有望為環(huán)境空氣污染物/致癌物的健康風(fēng)險(xiǎn)評估提供可行的技術(shù)支撐。
　　第一部分 CSE中CYP2A13的新底物5-HMF的發(fā)現(xiàn)與鑒定
　　目的:利用色譜技術(shù)結(jié)合細(xì)胞毒性評價(jià)，初步篩選CSE中與CYP2A13代謝相關(guān)的組分，并利用質(zhì)譜和核磁共振技術(shù)鑒定出候選化學(xué)

5、物。
　　方法:利用HPLC將CSE分離及通過B-2A13與B-V細(xì)胞毒性篩選毒性組分、候選組分的進(jìn)一步分離、純化后采用GC-MS/MS、NMR、HPLC鑒定，運(yùn)用純品進(jìn)行B-2A13與B-V細(xì)胞代謝毒性驗(yàn)證，并與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行毒性比對確認(rèn)。
　　結(jié)果:(1)利用HPLC將CSE分為尼古丁部分和非尼古丁部分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，非尼古丁部分對B-2A13細(xì)胞的毒性顯著增強(qiáng)，4％濃度時(shí)的細(xì)胞活力僅10％左右，且可被CYP酶抑制劑8-MOP所

6、逆轉(zhuǎn)，而尼古丁部分的毒性較弱;(2)按照CSE在HPLC中的保留時(shí)間按每10min收集為4組，分別處理B-2A13細(xì)胞和B-V細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前10min的組分細(xì)胞毒性最強(qiáng)，而含NNK的組分(10-20 min)并未顯示出明顯毒性;將前10min組分按每分鐘收集再處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)5min段的組分細(xì)胞毒性最強(qiáng);(3)將5min段的CSE組分進(jìn)行再分離、純化、濃縮后進(jìn)行鑒定，GC-MS/MS顯示該組分單體在4.88min處有明顯的吸收峰，結(jié)合離

7、子特征和數(shù)據(jù)庫，推定可能為5-羥甲基糠醛(5-HMF);NMR的檢測結(jié)果也證明，該物質(zhì)與5-HMF的結(jié)構(gòu)極為相似;(4)無論是HPLC檢測還是細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，均顯示該物質(zhì)與5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品完全一致。
　　結(jié)論:CSE中存在CYP2A13的新的底物，該物質(zhì)極有可能是5-HMF，且可被CYP2A13代謝活化增強(qiáng)其細(xì)胞毒性。
　　第二部分 CYP2A13對5-HMF的體外代謝活性研究
　　目的:構(gòu)建體外代謝反應(yīng)體系，評價(jià)CYP

8、2A13對5-HMF的體外代謝活性，明確兩者間的代謝關(guān)系。
　　方法:(1)為了獲得有蛋白活性的CYP2A13，建立了POR與CYP2A13蛋白在Baculovirus/sf9中共表達(dá)的體系:首先通過分子克隆構(gòu)建pFastBac-dual-POR-CYP2A13質(zhì)粒，再運(yùn)用DH10Bac大腸桿菌將其轉(zhuǎn)化為桿狀病毒DNA(Bacmid-POR-CYP2A13)，然后將桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)化入sf9細(xì)胞產(chǎn)生CYP2A13-POR的病毒液并

9、表達(dá)有代謝活性的CYP2A13和POR蛋白。(2)采用western blot檢測CYP2A13和POR蛋白的表達(dá)、經(jīng)CO差示光譜法和細(xì)胞色素C還原法分別檢測CYP2A13和POR蛋白的活性、以NNK為代謝底物檢驗(yàn)共表達(dá)CYP2A13和POR蛋白的代謝能力。(3)將制備的CYP2A13蛋白用于5-HMF的代謝研究中，分析其代謝產(chǎn)物，評價(jià)其代謝動力學(xué)和代謝活性。
　　結(jié)果:(1)采用Baculovirus/Sf9系統(tǒng)體外聯(lián)合表達(dá)CY

10、P2A13和POR蛋白，免疫印跡結(jié)果顯示，所獲得的微粒體蛋白中存在較明亮的CYP2A13和POR蛋白的特異性條帶，提示聯(lián)合表達(dá)成功;(2)經(jīng)CO差示光譜法和細(xì)胞色素C還原法，CYP2A13活性為0.62 pmol/min/pmol蛋白，POR蛋白的活性為38.9nmol/min/mg蛋白;采用CYP2A13的經(jīng)典底物NNK進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示表達(dá)的CYP2A13可顯著代謝NNK生成其代謝產(chǎn)物NNAL，代謝動力學(xué)結(jié)果顯示其代謝活性為:Vma

11、x(pmol/min/pmol):2.5±0.4; Km（μM）:12.0±2.6; Vmax/Km:0.208;進(jìn)一步提示所表達(dá)的CYP2A13表達(dá)具有良好的代謝活性;(3)CYP2A13可在120min內(nèi)將5-HMF完全代謝生成其代謝產(chǎn)物5-HMFA;代謝動力學(xué)結(jié)果顯示其代謝活性為:Vmax（pmol/min/pmol）:2.7±0.2; Km（μM）:50.9±8.3; Vmax/Km:0.05;結(jié)果提示CYP2A13對5-HMF

12、有較好的代謝活性。
　　結(jié)論:體外成功地表達(dá)了具有較好活性的CYP2A13和POR蛋白，5-HMF是CYP2A13的新的底物。
　　第三部分 CYP2A13/CYP2A5對CSE中5-HMF所致呼吸毒性的影響
　　目的:通過動物實(shí)驗(yàn)，初步闡明CYP2A13在代謝5-HMF及其所致小鼠呼吸系統(tǒng)急性損傷中的作用。
　　方法:小鼠CYP2A5與人CYP2A13同源，兩者在功能上非常接近，由于同步構(gòu)建的人源化CYP2A1

13、3小鼠未能在呼吸系統(tǒng)檢測到CYP2A13蛋白，因此采用同期構(gòu)建的CYP2A5敲除小鼠(CYP2A5-/-)進(jìn)行功能研究。(1)為評價(jià)CYP2A5與CYP2A13在代謝活化5-HMF中的功能差異，先利用pLJM慢病毒體系構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CYP2A5的BEAS-2B細(xì)胞(B-2A5);經(jīng)鑒定構(gòu)建成功后，檢測其5-HMF的代謝毒性，并與B-2A13細(xì)胞的代謝毒性相比較。(2)5-HMF鼻腔滴注染毒CYP2A5-/-小鼠以及野生型小鼠，通過病理學(xué)檢

14、查比較兩者的鼻腔、肺損傷;通過檢測肺泡灌洗液(BALF)中炎癥細(xì)胞數(shù)量與種類以及炎癥因子的表達(dá)比較兩者肺部炎癥情況。
　　結(jié)果:(1)經(jīng)GFP驗(yàn)證，擬構(gòu)建的B-2A5細(xì)胞綠色熒光明亮、充滿，轉(zhuǎn)染效率接近100％;(2)細(xì)胞毒性結(jié)果顯示，5-HMF對B-2A5和B-2A13細(xì)胞的毒性基本一致，且都可以被8-MOP所逆轉(zhuǎn)，提示CYP2A5對5-HMF也具有相近的代謝活化作用;(3)動物實(shí)驗(yàn)顯示，5-HMF處理的野生型小鼠可見鼻中隔粘膜

15、結(jié)構(gòu)破損斷裂、纖毛脫落，大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，而CYP2A5-/-小鼠的纖毛結(jié)構(gòu)完整、上皮細(xì)胞排列整齊;野生型小鼠的肺部炎癥明顯、肺泡壁細(xì)胞顯著增厚，而CYP2A5-/-小鼠肺的炎癥不明顯;5-HMF處理的野生型小鼠肺泡灌洗液中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞顯著高于5-HMF處理的CYP2A5-/-小鼠，肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-6、TNF-α的濃度也顯著升高。
　　結(jié)論:CYP2A5可顯著介導(dǎo)5-HMF的呼吸毒性，由于CYP