CCAAT增強子結(jié)合蛋白α在香煙煙霧提取物刺激人氣道平滑肌細胞細胞增殖中的作用機制.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分香煙提取物抑制人氣道平滑肌細胞CEBPα表達而促進了細胞增殖
　　目的:
　　在本研究中以不同濃度CSE刺激下體外培養(yǎng)人ASMCs，了解ASMCs的增殖情況以及相應(yīng)的CEBPα的表達，探討CEBPα在CSE促進了ASMCs的增殖中的作用。
　　方法:
　?。ㄒ唬?、制備不同濃度的香煙提取物。
　　（二）、采用siRNA技術(shù)轉(zhuǎn)染相應(yīng)的陰性對照siRNA、CEB

2、PαsiRNA。
　　（三）、分組。
　　按照不同CSE的濃度分組:2.5％CSE組、5％CSE組、10％CSE組、15％CSE組、20％ CSE組、對照組，比較各組間人ASMCs的增殖程度及CEBPα表達。
　?。ㄋ模?、MTT比色法分析人ASMCs的增殖程度（吸光度值OD490nm表示）。
　?。ㄎ澹?、采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測人ASMCs中CEBPα的mRNA水平。
　?。⒉捎妹庖?/p>

3、印跡法（Western blot法）檢測人ASMCs中CEBPα的表達。
　?。ㄆ撸⒔y(tǒng)計學(xué)方法:使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果:
　?。ㄒ唬?、不同CSE濃度作用下人ASMCs的增殖程度:
　　在2.5～10％CSE作用下，隨著CSE濃度的增高人ASMCs的增殖程度逐漸增加，在10％CSE作用下達到峰值，之后15％CSE、20％CSE濃度作用下細胞增殖程度出現(xiàn)下降趨勢。推測高于10％的CSE

4、可能存在直接細胞毒性作用，抑制了細胞增殖，故選取2.5～10％CSE作為后續(xù)試驗刺激濃度。
　　（二）、不同CSE濃度下人ASMCs的CEBPα的表達。
　　隨著CSE濃度的遞增，CEBPα蛋白表達逐漸減少，但CEBPαmRNA表達無差異。
　?。ㄈ⒃?0％CSE作用下，CEBPαsiRNA組、陰性對照siRNA組人ASMCs中CEBPα表達及細胞增殖程度的比較。
　　采用siRNA技術(shù)抑制人ASMCs中CE

5、BPα的表達后，細胞增殖程度反而增加。
　　結(jié)論:
　　本研究發(fā)現(xiàn)，在香煙提取物作用下，氣道平滑肌細胞下CEBPα蛋白表達受抑制，相應(yīng)的促進了細胞增殖。而這種CEBPα的蛋白的表達受抑制主要是受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的。在采用siRNA技術(shù)抑制CEBPα的蛋白表達后，人ASMCs的增殖反而增加，說明CEBPα在氣道平滑肌中扮演著抗細胞增殖作用。
　　第二部分香煙提取物對人氣道平滑肌細胞增殖中鈣網(wǎng)織蛋白及CEBPα表達的影響

6、　　目的:
　　在本研究中以不同濃度香煙提取物刺激下體外培養(yǎng)人氣道平滑肌細胞，了解抑制細胞增殖的重要因子CEBPα和其上游調(diào)控因子——鈣網(wǎng)織蛋白的表達，探討CEBPα上游調(diào)節(jié)因子鈣網(wǎng)織蛋白在香煙提取物促進氣道平滑肌細胞增殖中發(fā)揮的作用。
　　方法:
　　（一）、制備不同濃度的香煙提取物。
　?。ǘ⒉捎胹iRNA技術(shù)轉(zhuǎn)染相應(yīng)的鈣網(wǎng)織蛋白siRNA及陰性對照siRNA至人氣道平滑肌細胞。
　　（三）、分組<

7、br>　　1、按照不同CSE的濃度分組:2.5％ CSE組、5％CSE組、10％CSE組、15％CSE組、20％ CSE組、對照組，比較各組間ASMCs的增殖程度及CEBPα表達。
　　2、在10％CSE濃度條件下，進一步通過分別對ASMCs轉(zhuǎn)染鈣網(wǎng)織蛋白siRNA及陰性對照siRNA相應(yīng)分為鈣網(wǎng)織蛋白siRNA組及陰性對照siRNA組。比較兩組ASMCs的CEBPα、鈣網(wǎng)織蛋白的表達及細胞增殖程度的差異。
　　（四）、以M

8、TT比色法分析各組人ASMCs的增殖程度（吸光度值OD490nm表示）。
　?。ㄎ澹?、采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測各組人ASMCs中CEBPα的mRNA水平。
　?。⒉捎妹庖哂≯E法（Western blot法）檢測各組人ASMCs中CEBPα、鈣網(wǎng)織蛋白的表達。
　　（七）、統(tǒng)計學(xué)方法:使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。所有計量資料以(x)± s表示。多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性時

9、多重比較采用LSD法，方差不齊采用DuunettT3法。兩獨立樣本計量資料比較t檢驗。P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　?。ㄒ唬?、不同CSE濃度作用下人ASMCs的增殖程度:
　　高于10％的CSE可能存在直接細胞毒性作用，抑制了細胞增殖，故選取2.5～10％CSE作為后續(xù)試驗刺激濃度。
　?。ǘ⒉煌珻SE濃度下人ASMCs的CEBPα的表達。
　　隨著CSE濃度的遞增，CEBPα蛋白表達逐漸

10、減弱，但CEBPαmRNA表達無差異。
　?。ㄈ?、不同CSE濃度下人ASMCs中鈣網(wǎng)織蛋白表達。
　　隨著CSE濃度的遞增，鈣網(wǎng)織蛋白的表達逐漸增加。
　?。ㄋ模⒃?0％CSE作用下，鈣網(wǎng)織蛋白siRNA組、陰性對照siRNA組人ASMCs中鈣網(wǎng)織蛋白、CEBPα表達、細胞增殖程度的比較。
　　在10％CSE條件下，鈣網(wǎng)織蛋白siRNA組較陰性對照siRNA組中鈣網(wǎng)織蛋白表達減弱，但CEBPα表達增強，而相應(yīng)

11、地細胞增殖程度減弱。
　　結(jié)論:
　　本研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度CSE作用下，人氣道平滑肌細胞中鈣網(wǎng)織蛋白的表達隨著CSE濃度增加而增強，而CEBPα的蛋白表達隨著CSE濃度增加而減弱。采用siRNA技術(shù)抑制鈣網(wǎng)織蛋白表達后，反而CEBPα蛋白表達增強，繼而氣道平滑肌細胞增殖減弱。說明在一定濃度CSE作用下ASMCs中CEBPα的蛋白表達受抑制是受鈣網(wǎng)織蛋白調(diào)控的，進而影響了ASMCs的增殖。
　　第三部分香煙提取物通過CE

12、BPα調(diào)控細胞周期促進了人氣道平滑肌細胞增殖
　　目的:
　　在本研究中以不同濃度香煙提取物作用于體外培養(yǎng)人ASMCs，了解人ASMCs中抑制細胞增殖的重要因子CEBPα以及細胞周期重要限速酶CDK2、CDK4的表達變化，并分析細胞周期各期比例變化，另外，采用siRNA技術(shù)抑制CEBPα的表達后CDK2、CDK4的表達及細胞周期各期比例的變化，從而探討在香煙提取物作用下CEBPα是否通過調(diào)控細胞周期的分布而發(fā)揮其抑制細胞增殖

13、的作用。
　　方法:
　　（一）、制備不同濃度的香煙提取物。
　?。ǘ?、采用siRNA技術(shù)轉(zhuǎn)染相應(yīng)的CEBPαsiRNA、陰性對照siRNA。
　?。ㄈ⒎纸M
　　1、按照不同CSE的濃度分組:2.5％ CSE組、5％CSE組、10％CSE組、15％CSE組、20％CSE組及對照組，比較各組間人ASMCs的增殖程度及CEBPα表達。
　　2、在10％CSE濃度條件下，進一步通過分別對人ASMCs轉(zhuǎn)

14、染CEBPαsiRNA、陰性對照siRNA相應(yīng)分為CEBPαsiRNA組、陰性對照siRNA組。比較兩組人ASMCs的CEBPα表達、細胞周期分布及增殖程度的差異。
　　（四）、以MTT比色法分析人ASMCs的增殖程度（吸光度值OD490nm表示）。
　?。ㄎ澹?、采用免疫印跡法(Western blot法）檢測人ASMCs中CEBPα、CDK2及CDK4的表達。
　?。?、流式細胞儀進行細胞周期測定，計算各組人ASM

15、Cs中G0/G1期細胞比例、S期、G2/M期細胞比例。
　　（七）、使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。所有計量資料以(x)±s表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差齊性時多重比較采用LSD法，方差不齊采用DuunettT3法。兩獨立樣本均數(shù)計量資料比較t檢驗。P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　?。ㄒ唬⒉煌珻SE濃度下人ASMCs的增殖程度
　　高于10％的CSE可能存在直接細胞毒性作用，

16、故選取2.5～10％CSE作為后續(xù)試驗刺激濃度。
　?。ǘ?、2.5～10％CSE濃度下人ASMCs的CEBPα的表達
　　隨著CSE濃度的遞增，CEBPα蛋白表達逐漸減弱。
　?。ㄈ?、2.5～10％CSE濃度下人ASMCs的CDK2、CDK4的表達
　　隨著CSE濃度的遞增，CDK2、CDK4的表達均逐漸增加。
　?。ㄋ模?、2.5～10％CSE濃度下人ASMCs中G0/G1、S期、G2/M期細胞比例(％

17、)的比較。
　　隨著CSE濃度的遞增，G0/G1期細胞比例遞減，S期細胞比例遞增，G2/M期細胞無顯著變化。
　?。ㄎ澹⒃?0％CSE作用下，CEBPαsiRNA組、陰性對照siRNA組中CEBPα表達、細胞增殖程度及細胞周期分布的比較。
　　在10％CSE作用下，CEBPαsiRNA組較陰性對照siRNA組ASMCs中CEBPα表達減弱，而CDK2、CDK4表達增強，進而細胞周期中G0/G1期細胞比例顯著減少，同時