氯喹在紅內(nèi)期滅活全蟲疫苗抗紅內(nèi)期-紅外期中的作用及機制.pdf

1、瘧疾主要通過雌性按蚊叮咬傳播，在熱帶地區(qū)及亞熱帶地區(qū)具有非常高的致病率和致死率，它仍然是全球危害最大的熱帶傳染病之一。疫苗被認為是防治瘧疾最經(jīng)濟、最有效的手段。在過去50年里，科學(xué)家們主要致力于瘧疾亞單位疫苗的研制。然而，由于亞單位疫苗所針對的抗原決定簇相對較少，而且同一抗原在不同地理株之間存在明顯的多態(tài)性，現(xiàn)有的亞單位疫苗并沒有獲得非常理想的防治瘧疾效果。近年來，擁有豐富種類抗原的全蟲滅活疫苗再次受到了瘧疾專家的高度關(guān)注。研究已證實，

2、遺傳或物理減毒子孢子、物理滅活或遺傳減毒全蟲紅內(nèi)期疫苗均能有效地誘導(dǎo)小鼠和人類產(chǎn)生理想的免疫保護效果。
　　紅內(nèi)期滅活全蟲疫苗(Whole-killed blood stage vaccine)是由感染瘧原蟲的紅細胞經(jīng)反復(fù)凍融制備的裂解產(chǎn)物(pRBC lysate)，在免疫佐劑氫氧化鋁(alum)的輔助下，已證實能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較理想的免疫保護效果。然而，紅內(nèi)期滅活全蟲疫苗需要108數(shù)量級才能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫保護作用，滅活的紅內(nèi)期瘧

3、原蟲尚存在潛在的安全性問題，而且在實際推廣應(yīng)用中也受到明顯的限制。因此，如何提高紅內(nèi)期滅活全蟲疫苗的免疫原性，減少免疫劑量，是提高其在實際應(yīng)用中可能性的重要方法。其中，選擇合適的免疫佐劑是提高紅內(nèi)期滅活全蟲疫苗的免疫原性的重要策略之一。
　　氯喹(Chloroquine，CQ)，作為抗瘧藥物，于1947年正式投入使用[3]，它能有效地殺滅紅內(nèi)期瘧原蟲，但對紅外期子孢子則無明顯殺傷作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，CQ對機體的免疫系統(tǒng)具有一定

4、的免疫調(diào)節(jié)作用，但是關(guān)于CQ是抑制還是促進機體的免疫應(yīng)答尚存在很大的爭論。鑒此，本研究首先觀察了CQ能否增強紅內(nèi)期滅活全蟲疫苗的免疫原性及抵御紅內(nèi)期瘧原蟲的攻擊能力，并對其機制進行了初步的探討;另外，鑒于紅內(nèi)期和紅外期疫苗之間存在交叉保護作用，本研究還探討了CQ能否同樣增強紅內(nèi)期滅活全蟲疫苗抗紅外期子孢子的攻擊能力。
　　1.CQ增強紅內(nèi)期P.y NSM滅活全蟲疫苗的抗紅內(nèi)期效果:與對照組相比，滅活全蟲疫苗能一定程度上誘導(dǎo)小鼠抗紅

5、內(nèi)期的攻擊，但其保護效果并不理想。在滅活全蟲疫苗中添加CQ則能顯著提高免疫小鼠抵御紅內(nèi)期瘧原蟲攻擊的能力，在極短時間內(nèi)完全清除攻擊的紅內(nèi)期瘧原蟲，能100％的免疫保護機體，說明CQ能顯著增強紅內(nèi)期P.yNSM滅活全蟲疫苗的免疫效率。另外，間隔2W單獨給予CQ并不影響小鼠的原蟲血癥，說明殘留的CQ不是通過直接殺滅瘧原蟲而影響免疫效果的。
　　1) CQ增強紅內(nèi)期滅活全蟲疫苗的免疫效果與劑量相關(guān):不同劑量濃度的CQ(10mg/Kg，2

6、0mg/Kg，40mg/Kg)與P.y NSM紅內(nèi)期全蟲滅活疫苗(pRBC lysate+Alum)混合后免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)其免疫效果與CQ劑量具有一定的相關(guān)性，當(dāng)CQ濃度為20mg/Kg時，滅活全蟲疫苗免疫保護效果最佳。
　　2) CQ通過alum增強pRBC裂解產(chǎn)物的免疫原性:在用pRBCs lysate、CQ+pRBClysate、alum+ pRBC lysate、alum+CQ+pRBC lysate分別免疫小鼠后2W，用P

7、.y NSMpRBC攻擊，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CQ+pRBC lysate免疫也不能增強免疫小鼠的保護效果，說明CQ單獨并不能增強pRBC lysate的免疫原性;但是，與alum+ pRBC lysate相比，alum+CQ+pRBC lysate能大幅度提高免疫小鼠的保護效果，說明CQ可能是通過alum增強pRBC裂解產(chǎn)物的免疫原性的。
　　2.CQ促進紅內(nèi)期P.y NSM滅活全蟲疫苗抗紅內(nèi)期免疫的機制初探:
　　1)抗體是CQ增

8、強紅內(nèi)期P.y NSM滅活全蟲疫苗免疫原性的重要因素:小鼠經(jīng)末次免疫兩周后，流式檢測小鼠的GC B細胞頻率以及ELISA檢測IgG濃度，發(fā)現(xiàn)alum+CQ+pRBC lysate免疫小鼠的GC B細胞頻率和瘧原蟲特異性IgG滴度明顯升高。為驗證抗體在滅活全蟲疫苗誘導(dǎo)的小鼠保護性免疫中的作用，在末次免疫兩周后，分別收集alum+ pRBC lysate、alum+CQ+pRBC lysate免疫小鼠的血清，并過繼轉(zhuǎn)移到na(i)ve受體鼠

9、體內(nèi)，然后用等量的P.yNSM pRBC攻擊，發(fā)現(xiàn)過繼alum+CQ+pRBC lysate免疫血清的小鼠的原蟲血癥明顯低于過繼alum+ pRBC lysate的免疫血清。
　　2) CD4+T細胞是CQ增強紅內(nèi)期P.yNSM滅活全蟲疫苗免疫原性的另一重要因素:小鼠經(jīng)末次免疫兩周后，F(xiàn)ACS檢測小鼠脾臟內(nèi)瘧原蟲特異性CD4+T細胞的增殖能力以及IFN-γ的分泌水平，發(fā)現(xiàn)alum+CQ+pRBC lysate免疫小鼠CD4+T細胞

10、的增殖能力更強且IFN-γ的表達明顯高于alum+pRBC lysate免疫組。同時，小鼠末次免疫兩周后，體內(nèi)耗竭CD4+T細胞，然后用P.y NSM紅內(nèi)期瘧原蟲攻擊。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)拮抗CD4+T細胞后，alum+CQ+pRBC lysate免疫小鼠的原蟲血癥明顯升高。
　　二、CQ并不能增強紅內(nèi)期P.y NSM滅活全蟲疫苗的抗紅外期效果
　　1.紅內(nèi)期P.y NSM滅活全蟲疫苗能交叉抵御子孢子的攻擊:紅內(nèi)期P.y NSM滅

11、活全蟲疫苗免疫后，用紅外期子孢子攻擊免疫小鼠后檢測其肝期蟲荷，與空白對照組相比，免疫小鼠的肝期蟲荷明顯降低;同時，檢測免疫小鼠的紅內(nèi)期原蟲血癥，發(fā)現(xiàn)免疫小鼠的原蟲血癥明顯低于空白對照組，說明紅內(nèi)期P.yNSM滅活全蟲疫苗對紅外期同樣具有免疫保護作用。
　　2.CD8+T細胞而非CD4+T細胞在紅內(nèi)期P.y NSM滅活全蟲疫苗抗紅外期中起重要作用:末次免疫兩周后，體內(nèi)分別拮抗免疫小鼠體內(nèi)的CD4+、CD8+T細胞，然后子孢子攻擊檢測

12、其肝期蟲荷以及原蟲血癥，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)拮抗CD4+T細胞后其肝期蟲荷無顯著變化;而體內(nèi)拮抗CD8+T細胞后其肝期蟲荷則明顯升高。同時，CD8+T細胞拮抗組的紅內(nèi)期原蟲提前2天出現(xiàn)，而CD4+T細胞拮抗組則無明顯變化，說明CD8+T細胞而非CD4+T細胞在紅內(nèi)期P.y NSM滅活全蟲疫苗抗紅外期中起重要作用。
　　3.CQ并不能增強紅內(nèi)期P.y NSM滅活全蟲疫苗的抗紅外期效果:小鼠末次免疫后，子孢子攻擊檢測小鼠肝臟蟲荷，發(fā)現(xiàn)CQ+滅活全