基于巨噬細(xì)胞極化調(diào)控的青藤堿4-羥基棕櫚酸酯抗炎機(jī)制研究.pdf

1、青藤堿(sinomenino,SIN)是一種來(lái)源于防己科植物毛青藤（Sinomenium actum Rehd.et wils.Var cinerrum Rehd.et wils）及青藤（Sinomenium actum Rehd.et wils.）干燥藤莖的生物堿類(lèi)成分，其結(jié)構(gòu)與嗎啡相似。臨床上用其鹽酸鹽或者磷酸鹽的制劑治療風(fēng)濕性疾病及心率失常等。但是，長(zhǎng)期使用發(fā)現(xiàn)其存在用量大、起效慢、半衰期短等缺陷。本課題組對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，合成了

2、一系列青藤堿4-羥基酯化物，前期的工作中發(fā)現(xiàn)青藤堿4-羥基棕櫚酸酯(C16)有很好的抗炎效果。
　　內(nèi)毒素血癥是全身性的多器官衰竭的惡性炎癥反應(yīng)，死亡率極高。在臨床上尤其是創(chuàng)傷外科，一直是難以克服的一大難題。巨噬細(xì)胞是一種重要的免疫細(xì)胞，在不同的微環(huán)境中或者細(xì)胞因子的刺激下，可以極化為M1或M2型。巨噬細(xì)胞根據(jù)其功能亞型的不同，參與不同信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。
　　所以，本研究在LPS誘導(dǎo)的小鼠內(nèi)毒素血癥模型上，對(duì)C16進(jìn)行抗炎活性

3、評(píng)價(jià)；探究C16基于調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化相關(guān)的抗炎機(jī)制，具體工作如下：
　　(1) C16的制備及毒副作用評(píng)價(jià)
　　根據(jù)前藥設(shè)計(jì)與拼合原理，以DMAP為催化劑，EDC為縮合劑，青藤堿4位羥基取代反應(yīng)與棕櫚酸結(jié)合，制備青藤堿4-羥基棕櫚酸酯，并對(duì)其進(jìn)行核磁共振氫譜以及質(zhì)譜的結(jié)構(gòu)鑒定?？疾霤16對(duì)小鼠的肝腎毒性，檢測(cè)血清指標(biāo)ALT、AST的活性以及BUN的含量；對(duì)肝臟、腎臟做組織病理切片觀察。結(jié)果表明，與模型組相比，C16作用后，各

4、生化指標(biāo)顯著降低，小鼠肝、腎組織無(wú)明顯損傷。
　　(2)C16對(duì)LPS所致內(nèi)毒素血癥小鼠的治療作用
　　將10 mg/mL LPS注射于小鼠腹腔，建立內(nèi)毒素血癥模型。在此模型上，考察C16高、低劑量作用下的抗炎作用，并與其先導(dǎo)化合物SIN作對(duì)照。發(fā)現(xiàn)C16與SIN作用后，感染內(nèi)毒素血癥的小鼠存活率顯著提高；與模型組相比，外周血清中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)顯著降低；心、脾、肺和腎臟組織中炎癥因子IL-1β

5、和IL-6 mRNA表達(dá)也相應(yīng)的降低。C16高劑量組抗炎作用效果強(qiáng)于低劑量組，且與SIN相比，作用效果更明顯。
　　(3)C16對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用
　　在體外巨噬細(xì)胞模型上，采用MTT法檢測(cè)C16對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的影響；采用流式細(xì)胞術(shù)分析C16對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，C16在5?M以下對(duì)細(xì)胞增殖沒(méi)有明顯的抑制作用，對(duì)細(xì)胞凋亡也無(wú)顯著影響。該部分工作為下步實(shí)驗(yàn)優(yōu)選了合適的作用濃度。之后，采用500 ng/mL LPS誘

6、導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型極化；20 ng/mL IL-4誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化。在傳代巨噬細(xì)胞ANA-1以及原代腹腔巨噬細(xì)胞模型上，采用多種方法檢測(cè)了巨噬細(xì)胞 M1型和 M2型相關(guān)因子的表達(dá)。qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞中iNOS、Arg-1、CD206、Ym1以及Fizz1 mRNA的表達(dá)；試劑盒檢測(cè)了iNOS和Arg-1的酶活性；Western Blot分析了細(xì)胞中iNOS和Arg-1在蛋白水平的改變；ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中炎

7、癥因子IL-1β與TNF-α的含量。多種方法綜合分析發(fā)現(xiàn)，C16作用后，與模型組相比，M1型相關(guān)因子在不同水平的表達(dá)都顯著下降，M2型相關(guān)因子在不同水平的表達(dá)都顯著上升。結(jié)果表明，C16能很好的抑制巨噬細(xì)胞向M1型極化，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化。
　　(4)C16調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的分子機(jī)制
　　該部分采用Western Blot技術(shù)，檢測(cè)了MAPK、JAK/STAT、PI3K/AKT通路的相關(guān)信號(hào)的表達(dá)。分別檢測(cè)了p38、S