丹參酚酸A對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生抗氧化、抗凋亡和抗炎的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)旨在觀察丹參酚酸A(SAA)對(duì)血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生抗氧化、抗凋亡和抗炎作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，研究SAA在抗動(dòng)脈粥樣硬化方面的作用，為今后SAA臨床應(yīng)用治療動(dòng)脈粥樣硬化性疾病提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：1.本實(shí)驗(yàn)所用昆明小鼠均購(gòu)自徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。2.本實(shí)驗(yàn)成功培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，并對(duì)培養(yǎng)的原代細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和巨噬細(xì)胞表面特征性標(biāo)志CD68分子進(jìn)行免疫熒光鑒定。3

2、.實(shí)驗(yàn)分組為:(1)對(duì)照組;(2) AngⅡ組;(3)AngⅡ+SAA12.5μM;(4)AngⅡ+SAA25μM;(5)AngⅡ+SAA50μM。4.噻唑藍(lán)(MTT)比色法觀察細(xì)胞活力;黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性，硫代巴比妥酸化學(xué)比色法(TBA)測(cè)定MDA含量;免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)測(cè)定Bcl-2、Bax、Akt、p-Akt(308)、p-Akt(473)、NF-κBp65和p-NF-κBp65蛋白的表達(dá);用TUN

3、EL染色法檢測(cè)巨噬細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果：1.原代培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞24小時(shí)后貼壁且生長(zhǎng)狀態(tài)良好;活化和成熟的巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志CD68分子的表達(dá)陽(yáng)性率大于99％。2.MTT結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，不同濃度的SAA(6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM)未見(jiàn)明顯細(xì)胞毒性(P＞0.05)。與對(duì)照組相比，AngⅡ能明顯抑制巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活力(P≤0.05)而采用SAA預(yù)處理后能使巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活力增高(P≤0

4、.05)，并呈濃度依賴性。3.MDA及SOD檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，AngⅡ顯著增加巨噬細(xì)胞MDA的釋放、抑制SOD的釋放，而采用不同濃度的SAA預(yù)處理后可以減少M(fèi)DA的釋放和增加SOD的釋放(P≤0.05)，起到抗氧化作用。4.TUNEL染色結(jié)果顯示，正常培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞存在一定比例的凋亡細(xì)胞，AngⅡ組的細(xì)胞凋亡率明顯升高（P≤0.05)，而采用SAA(50μM)預(yù)處理后能夠明顯降低細(xì)胞凋亡率(P≤0.05)。5.與對(duì)照組相比，A

5、ngⅡ能夠顯著增加巨噬細(xì)胞促凋亡蛋白Bax的表達(dá)(P≤0.05)，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)(P≤0.05)，SAA預(yù)處理后則能不同程度地減少Bax蛋白的表達(dá)(P≤0.05)，增加Bcl-2的表達(dá)(P≤0.05)。6.與對(duì)照組相比，AngⅡ組巨噬細(xì)胞p-Akt和p-NF-κBp65的表達(dá)增加(P≤0.05)，不同濃度的SAA預(yù)處理能夠不同程度地降低巨噬細(xì)胞p-Akt和p-NF-κBp65的表達(dá)(P≤0.05)。p-Akt在AngⅡ刺

6、激后5min活化水平最高，p-Akt(308)在15min時(shí)降低至本底水平，而p-Akt(473)在60min降至本底水平，加入SAA預(yù)處理后可使得Akt和NF-κBp65磷酸化水平表達(dá)降低。
　　結(jié)論：1.SAA能夠顯著增強(qiáng)被AngⅡ抑制的巨噬細(xì)胞活力，并呈濃度依賴性。2.SAA預(yù)處理后可以抑制MDA的釋放、增加SOD的釋放，發(fā)揮其抗氧化作用。3.SAA預(yù)處理可減少TUNEL染色陽(yáng)性凋亡細(xì)胞數(shù)，減少巨噬細(xì)胞Bax的表達(dá)，增加Bc