鹽酸青藤堿酶法羥基化的初步研究.pdf

1、青藤堿為異喹啉型生物堿，主要分布于中藥青風藤的根和莖中，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、降壓、抗心律失常等多種生物活性，應用前景廣闊。但青藤堿在臨床使用過程存在一些缺陷，比如水溶性較小，生物半衰期較短，對光、熱不穩(wěn)定，易分解等。為此各國研究人員對青藤堿進行一系列的研究，修飾改造其分子結構，以提高生物利用度，改良天然植物分子特性，以及創(chuàng)制新藥。本課題旨在采用微生物生物氧化法制備青藤堿衍生物，在龐大而復雜的青藤堿分子中引入活性基團，以便提高青藤堿的生物活性

2、和提供進一步化學修飾的可能性。
　　 本論文主要通過微生物法進行青藤堿生物氧化研究，期望得到羥基化青藤堿。主要內(nèi)容包括青藤堿的微生物轉(zhuǎn)化羥基化的實驗研究，酶催化青藤堿羥基化的工藝條件優(yōu)化，羥基化青藤堿衍生物的分離純化，羥基化青藤堿衍生物的結構表征以及固定化細胞催化青藤堿羥基化工藝的初步研究。
　　 首先，通過對本實驗室保藏的具有生物氧化還原功能的菌株進行篩選，選育出一株具有對青藤堿生物氧化功能的菌株簡單節(jié)桿菌Arthro

3、bacter simplexNG0601；其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物通過質(zhì)譜、紅外光譜和核磁共振譜解析，初步確定產(chǎn)物為C14-羥基化青藤堿；以Arthrobacter simplex NG0601為出發(fā)菌株，進行紫外誘變后，篩選得到一株高產(chǎn)菌株Arthrobacter simplex NG0601-10，青藤堿羥基化的轉(zhuǎn)化率由.5.61％提高至10。19％，且遺傳性狀穩(wěn)定，由此得到了本課題的實驗菌株。
　　 其后，對Arthrobacter s

4、implex NG0601-10轉(zhuǎn)化青藤堿C14-羥基化工藝進行優(yōu)化。通過響應面分析實驗設計法，確定了搖瓶最佳培養(yǎng)基配方：葡萄糖14.7g/L，玉米漿10.1g/L，酵母膏10.1g/L，K.2HPO42g/L，MgSO48mg/L，pH7.0。在優(yōu)化的培養(yǎng)基條件下，建立了適宜的靜息細胞催化青藤堿羥基化的工藝條件：底物濃度3g/L，反應液初始pH7.5，反應溫度28℃，反應48h。反應液中添加2g/L葡萄糖可供細胞代謝自生NADPH，解

5、決輔酶再生問題。
　　 轉(zhuǎn)化反應結束后，對反應液中C14-羥基化青藤堿的提取和分離純化進行了研究，選用732型強酸性陽離子交換樹脂，常溫下對pH值為7.5的反應液中的青藤堿和C14-羥基青藤堿進行吸附，然后采用0.5mol/L的HCl進行洗脫，洗脫流速為0.08mL/s；洗脫液用NaHCO3飽和溶液進行中和后，調(diào)整溶液pH值為11.0，常溫下采用氯仿萃取一次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到青藤堿和C14-羥基青藤堿的混合物，最后采用乙醇作為溶劑，

6、依次采用蒸發(fā)溶劑結晶和冷卻結晶的方法得到了高純度的C14-羥基化青藤堿結晶。
　　 本論文還對固定化簡單節(jié)桿菌NG0601-10羥基化青藤堿進行了初步研究，得到較佳的固定化細胞制備方法，固定化材料為PVA15％和海藻酸鈉1％，菌體包埋量為0.3％，固定液為30g/L硼酸和20g/L的氯化鈣混合溶液，固化時間24h。采用上述條件制備得到的固定化細胞進行鹽酸青藤堿的羥基化反應，得到較佳的反應條件為：選用0.1mol/L的 Tris-