鹽酸青藤堿酶法羥基化的初步研究.pdf

1、青藤堿為異喹啉型生物堿，主要分布于中藥青風(fēng)藤的根和莖中，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、降壓、抗心律失常等多種生物活性，應(yīng)用前景廣闊。但青藤堿在臨床使用過程存在一些缺陷，比如水溶性較小，生物半衰期較短，對光、熱不穩(wěn)定，易分解等。為此各國研究人員對青藤堿進(jìn)行一系列的研究，修飾改造其分子結(jié)構(gòu)，以提高生物利用度，改良天然植物分子特性，以及創(chuàng)制新藥。本課題旨在采用微生物生物氧化法制備青藤堿衍生物，在龐大而復(fù)雜的青藤堿分子中引入活性基團(tuán)，以便提高青藤堿的生物活性

2、和提供進(jìn)一步化學(xué)修飾的可能性。
　　 本論文主要通過微生物法進(jìn)行青藤堿生物氧化研究，期望得到羥基化青藤堿。主要內(nèi)容包括青藤堿的微生物轉(zhuǎn)化羥基化的實驗研究，酶催化青藤堿羥基化的工藝條件優(yōu)化，羥基化青藤堿衍生物的分離純化，羥基化青藤堿衍生物的結(jié)構(gòu)表征以及固定化細(xì)胞催化青藤堿羥基化工藝的初步研究。
　　 首先，通過對本實驗室保藏的具有生物氧化還原功能的菌株進(jìn)行篩選，選育出一株具有對青藤堿生物氧化功能的菌株簡單節(jié)桿菌Arthro

3、bacter simplexNG0601；其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物通過質(zhì)譜、紅外光譜和核磁共振譜解析，初步確定產(chǎn)物為C14-羥基化青藤堿；以Arthrobacter simplex NG0601為出發(fā)菌株，進(jìn)行紫外誘變后，篩選得到一株高產(chǎn)菌株Arthrobacter simplex NG0601-10，青藤堿羥基化的轉(zhuǎn)化率由.5.61％提高至10。19％，且遺傳性狀穩(wěn)定，由此得到了本課題的實驗菌株。
　　 其后，對Arthrobacter s

4、implex NG0601-10轉(zhuǎn)化青藤堿C14-羥基化工藝進(jìn)行優(yōu)化。通過響應(yīng)面分析實驗設(shè)計法，確定了搖瓶最佳培養(yǎng)基配方：葡萄糖14.7g/L，玉米漿10.1g/L，酵母膏10.1g/L，K.2HPO42g/L，MgSO48mg/L，pH7.0。在優(yōu)化的培養(yǎng)基條件下，建立了適宜的靜息細(xì)胞催化青藤堿羥基化的工藝條件：底物濃度3g/L，反應(yīng)液初始pH7.5，反應(yīng)溫度28℃，反應(yīng)48h。反應(yīng)液中添加2g/L葡萄糖可供細(xì)胞代謝自生NADPH，解

5、決輔酶再生問題。
　　 轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，對反應(yīng)液中C14-羥基化青藤堿的提取和分離純化進(jìn)行了研究，選用732型強酸性陽離子交換樹脂，常溫下對pH值為7.5的反應(yīng)液中的青藤堿和C14-羥基青藤堿進(jìn)行吸附，然后采用0.5mol/L的HCl進(jìn)行洗脫，洗脫流速為0.08mL/s；洗脫液用NaHCO3飽和溶液進(jìn)行中和后，調(diào)整溶液pH值為11.0，常溫下采用氯仿萃取一次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到青藤堿和C14-羥基青藤堿的混合物，最后采用乙醇作為溶劑，

6、依次采用蒸發(fā)溶劑結(jié)晶和冷卻結(jié)晶的方法得到了高純度的C14-羥基化青藤堿結(jié)晶。
　　 本論文還對固定化簡單節(jié)桿菌NG0601-10羥基化青藤堿進(jìn)行了初步研究，得到較佳的固定化細(xì)胞制備方法，固定化材料為PVA15％和海藻酸鈉1％，菌體包埋量為0.3％，固定液為30g/L硼酸和20g/L的氯化鈣混合溶液，固化時間24h。采用上述條件制備得到的固定化細(xì)胞進(jìn)行鹽酸青藤堿的羥基化反應(yīng)，得到較佳的反應(yīng)條件為：選用0.1mol/L的 Tris-