陳皮生物堿抗小鼠肺纖維化相關(guān)PGE2信號(hào)通路的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的:
　　通過博來霉素(Bleomycin，BLM)誘導(dǎo)小鼠肺纖維化，建立肺纖維化模型，經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)篩選陳皮生物堿及其鹽酸鹽中抗肺成纖維細(xì)胞活性最強(qiáng)的成分，進(jìn)一步通過體內(nèi)研究觀察其生物堿對(duì)小鼠肺纖維化模型的肺組織形態(tài)學(xué)改變及相關(guān)前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)信號(hào)通路的影響，探討陳皮生物堿干預(yù)肺纖維化作用的潛在機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.體外實(shí)驗(yàn):通過BLM(5mg/kg)氣管內(nèi)滴注法

2、誘導(dǎo)小鼠肺纖維化，建立肺纖維化模型，取小鼠肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，用四氮唑鹽比色(Methylthiazol tetrazolium，MTT)法篩選陳皮生物堿及其鹽酸鹽（對(duì)羥基苯乙胺、辛弗林、N-甲基-4-甲氧基-β-苯乙胺、對(duì)甲氧基苯乙胺、N-甲基酪胺，編號(hào)為A～E，其鹽酸鹽為A1～E1）中活性最強(qiáng)的部分，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的影響，進(jìn)行乳酸脫氫酶(Lactic dehydrogenase，LDH)活性檢測(cè)，測(cè)定其細(xì)胞毒性。
　　

3、2.體內(nèi)試驗(yàn):將小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陳皮生物堿高劑量組(100mg/kg/day)、陳皮生物堿中劑量組(50mg/kg/day)、陳皮生物堿低劑量組(25mg/kg/day)及強(qiáng)的松組(6mg/kg/day)，除正常組外，剩余組建立小鼠肺纖維化模型，于造模成功后第14天開始通過相應(yīng)藥物灌胃（其中正常組及模型組給予0.9％氯化鈉注射液灌胃，高劑量組、中劑量組、低劑量組及強(qiáng)的松組給予相應(yīng)濃度的藥物灌胃）。動(dòng)態(tài)觀察小鼠活動(dòng)量、進(jìn)食情況

4、、毛發(fā)光澤及精神狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)第28天處死小鼠取血和肺組織樣本，肺組織病理切片炎癥評(píng)分評(píng)估小鼠肺纖維化的嚴(yán)重程度;應(yīng)用ELISA法檢測(cè)羥脯氨酸(Hydroxyproline，HYP)、轉(zhuǎn)化生長因-β1 Transforming growth factor-β1，TGF-β1）、PGE2含量;應(yīng)用Westernblot法檢測(cè)肺組織中TGF-β1、環(huán)氧化酶2(Cyclooxygenases-2，COX-2)、前列腺素E2受體（Prostagla

5、ndin E2 receptor，EP2）蛋白表達(dá)水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.陳皮生物堿及其鹽酸鹽中活性最強(qiáng)的為對(duì)羥基苯乙胺鹽（編號(hào)為:A1），A1在50、25、12.5、6.25、3.125μM時(shí)其抑制率分別為:46.36％、26.71％、19.53％、5.32％、5.27％; A1在50、25、12.5tM時(shí)LDH活性(U/L)分別為176.11±14.87、159.30±11.29、152.93±9.45，與正常組

6、(148.16±6.38)相比P＞0.05，抑制小鼠肺成纖維細(xì)胞的增殖作用為其藥物活性，而非細(xì)胞毒性作用。
　　2.高、中、低劑量組小鼠終體重(g)分別為:26.95±0.95、26.65±0.63、26.08±0.95，與模型組(23.90±1.70)相比P＜0.01或P＜0.05。
　　3.高劑量組肺泡炎、肺纖維化積分分別為:1.00±1.10、1.17±0.75，顯著低于模型組(P＜0.05或P＜0.01)。
　

7、　4.高劑量組、強(qiáng)的松組小鼠血清中TGF-β1含量與模型組相比P＜0.01，具有顯著差異，即高劑量組和強(qiáng)的松組能夠顯著降低小鼠血清中TGF-β1含量。
　　5.高劑量組及強(qiáng)的松組小鼠肺組織中HYP含量與模型組相比P＜0.01或P＜0.05，即高劑量組和強(qiáng)的松組可以顯著降低小鼠血清中HYP含量。
　　6.高劑量組的小鼠肺組織中PGE2含量與模型組相比P＜0.01，即高劑量組能夠使PGE2含量顯著增加。
　　7.高、中、低

8、劑量組及強(qiáng)的松組小鼠肺組織中TGF-β1蛋白表達(dá)水平與模型組相比P＜0.01，有顯著差異，即高、中、低劑量組和強(qiáng)的松組均能降低小鼠肺組織中的TGF-β1的蛋白表達(dá)水平。
　　8.高劑量組的小鼠肺組織中COX-2蛋白表達(dá)水平與模型組相比P＜0.01，高劑量組能夠提高COX-2蛋白表達(dá)水平。
　　9.高劑量組的小鼠肺組織中EP2蛋白表達(dá)水平與模型組相比P＜0.01，高劑量組能夠提高EP2蛋白表達(dá)水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論: