載SDF-1α溫度敏感性水凝膠防宮腔粘連及促子宮內(nèi)膜再生修復的效果研究.pdf

1、目的:
　　宮腔粘連(intrauterine adhesions，IUA)是一種繼發(fā)于子宮內(nèi)膜機械或感染性損傷的疾病。正常子宮內(nèi)膜修復時不會有瘢痕形成，然而當修復機制出現(xiàn)異常，則會導致IUA形成。目前常采用宮腔鏡下粘連分離切除術聯(lián)合應用人工周期刺激子宮內(nèi)膜再生的方法進行治療，但對重度粘連的患者療效不佳，術后往往由于宮腔創(chuàng)面缺乏有效阻隔，以及子宮內(nèi)膜基底部受損導致修復障礙而引起粘連復發(fā)。宮腔粘連分解術后于宮腔內(nèi)放置支架，能夠部分阻

2、隔宮腔創(chuàng)面預防再粘連，但存在分離效果有限、易引起逆行感染等問題。此外，更重要的是，重度宮腔粘連往往由于子宮內(nèi)膜基底層損傷導致粘連復發(fā)。因此，研究更加安全、有效分隔宮腔創(chuàng)面，兼具誘導干細胞歸巢修復內(nèi)膜損傷的宮腔緩釋支架，是治療IUA的當務之急。
　　材料的選擇是研究宮腔緩釋支架的基礎。生物可降解高分子材料是組織工程領域的研究熱點之一，其中，溫度敏感性水凝膠能對環(huán)境溫度作出智能響應，發(fā)生溶膠相（液態(tài)）與凝膠相（半固態(tài)）的可逆性轉變?？?/p>

3、在體外低溫環(huán)境下保持液態(tài)，通過宮頸口注入宮腔后在體溫的刺激下轉變成適應宮腔形狀的半固態(tài)，從而起到理想的屏障作用，且能負載生物活性因子，是宮腔內(nèi)緩釋材料的理想選擇。
　　近年來，有研究者把骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cellsBM-MSCs)作為種子細胞，移植到子宮內(nèi)膜損傷的小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)BM-MSCs可定植于正常以及損傷的子宮內(nèi)膜組織中，并可促進小鼠子宮內(nèi)膜損傷部位的修復。然而此方法

4、在臨床應用中存在MSCs分離、提純及擴增困難等問題。若通過“干細胞歸巢”的方式則可避免這些問題?！皻w巢”描述了干/祖細胞的遷移特點，是一個多步驟協(xié)調(diào)的過程，許多細胞因子、化學因子和細胞外基質(zhì)參與其中，主要是通過一系列趨化因子-趨化因子受體效應軸來實現(xiàn)。目前研究較廣的是CXCL12-CXCR4效應軸，CXCL12（SDF-1）為低氧敏感性分子，當組織缺氧時引起SDF-1表達增高，干/祖細胞循SDF-1濃度“歸巢”至損傷組織，促進組織再生和

5、修復。
　　方法:
　　1.1 PLEL-BSA復合水凝膠的準備及其蛋白緩釋實驗
　　我們用固體PDLLA-PEG-PDLLA(PLEL)三嵌段聚合物配制了20wt％的水凝膠，升溫至37℃，測試其在體溫下發(fā)生溶膠相至凝膠相的轉變能力。然后將牛血清白蛋白(BSA)與PLEL水凝膠物理混合制成PLEL-BSA復合水凝膠，置于37℃培養(yǎng)箱中，模擬體內(nèi)環(huán)境，分時段收集釋放的BSA，測定計算BSA的釋放速率。
　　1.2

6、rhSDF-1α對BM-MSCs的趨化作用實驗
　　分離培養(yǎng)并鑒定新西蘭兔BM-MSCs，利用transwell系統(tǒng)驗證rhSDF-1α對BM-MSCs的趨化作用。制備PLEL-rhSDF-1α復合水凝膠用于動物實驗:11只成年新西蘭雌兔（22條子宮）分為4組:自然修復組（n=6），沿子宮長軸縱形剪開，剪去子宮內(nèi)膜，止血后縫合子宮縱形切口;PLEL治療組（n=6），縫合后向?qū)m腔內(nèi)注射PLEL水凝膠;PLEL-rhSDF-1α治療組

7、(n=6)，縫合后向?qū)m腔內(nèi)注射復合rhSDF-1α的PLEL水凝膠;假手術組(n=4)，僅行開腹手術，不處理子宮，術后7天比較PLEL-rhSDF-1α治療組、單純PLEL治療組MSCs的歸巢定植情況。
　　1.3 PLEL-rhSDF-1α預防宮腔粘連及促進子宮內(nèi)膜再生修復的效果研究
　　動物造模及分組同上，術后28天取子宮標本行組織切片HE染色及免疫組化染色。
　　結果:
　　2.1 PLEL水凝膠相轉變特性

8、及PLEL-BSA復合水凝膠的蛋白累積釋放曲線
　　PLEL水凝膠在溫度上升至(32-35)℃時由溶膠相轉變?yōu)槟z態(tài)。我們在體外模擬宮腔環(huán)境，將PLEL-BSA水凝膠凝膠化后置于37℃PBS中可保持形態(tài)超過3d，3d后發(fā)生明顯溶蝕。PLEL-BSA復合水凝膠的蛋白累積釋放曲線顯示BSA緩釋時間超過3d。
　　2.2 rhSDF-1α對BM-MSCs的趨化作用
　　體外BM-MSCs的遷移實驗顯示實驗組為54.330±9

9、.424，兩對照組分別為26.070±7.285及27.730±6.649，可見僅transwell小室下室加入rhSDF-1α時，BM-MSCs遷移數(shù)量明顯增多，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而兩對照組間無明顯差異。
　　術后7d，治療組子宮標本CD44及CD90免疫熒光染色顯示有MSCs歸巢至再生內(nèi)膜組織，PLEL-rhSDF-1α治療組歸巢MSCs細胞密度為(5357.7±1355.5)/mm2較PLEL治

10、療組(1496.5±650.9)/mm2約為3.6倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.3 PLEL-rhSDF-1α預防宮腔粘連及促進子宮內(nèi)膜再生修復的效果
　　術后28d，自然修復組由于宮腔粘連閉塞，而PLEL治療組和PLEL-rhSDF-1α治療組子宮形態(tài)較規(guī)則;組織切片HE染色顯示自然修復組宮腔內(nèi)無上皮樣組織出現(xiàn)，宮腔完全閉塞，而治療組有連續(xù)的上皮樣組織覆蓋宮腔;上皮細胞角蛋白染色后統(tǒng)計內(nèi)膜上皮層周長與基底

11、層周長之比，假手術組(1.562±0.120)明顯較其他各組大(P＜0.05)，PLEL治療組比值(0.441±0.161)較自然修復組(0.017±0.040)大(P＜0.05)，而PLEL-rhSDF-1α治療組比值(0.878±0.131)較PLEL治療組大（P＜0.05）。CD34染色后比較各組間血管密度，PLEL-rhSDF-1α治療組(14.556±3.142)與假手術組(14.037±2.942)接近(P＞0.05);兩組