STAT3-siRNA-前胸腺素α共負(fù)載熱敏性納米膠束對腫瘤相關(guān)樹突狀細(xì)胞免疫功能調(diào)控的影響.pdf

1、目的：將負(fù)載前胸腺素（ProTα）多肽片段，具有溫度敏感性的聚合物膠束用于負(fù)載STAT3-siRNA到達(dá)腫瘤相關(guān)樹突狀細(xì)胞（TADCs），下調(diào)STAT3蛋白的表達(dá)，調(diào)控腫瘤相關(guān)樹突狀細(xì)胞的功能，發(fā)揮其體內(nèi)免疫抗腫瘤效果。
　　方法：通過酰胺鍵反應(yīng)合成殼聚糖接枝的泊洛沙姆（PO-CS）載體，采用FT-IR和1H-NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)驗(yàn)證，并用芘探針測量其形成膠束后的臨界膠束濃度。在溶液中形成膠束后，利用馬爾文粒徑電位測定儀中測量其粒徑和電

2、位大小，同時測量15℃，25℃和37℃條件下膠束的粒徑變化考察其溫度敏感性。本實(shí)驗(yàn)還分別測量了泊洛沙姆（PO）、殼聚糖（CS）以及 PO-CS載體在不同溫度下的粒徑變化情況來考察該膠束的溫度敏感性來源。將制備好的膠束置于透射電鏡（TEM）中觀察其表面形態(tài)，并通過瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證膠束對siRNA的保護(hù)作用。利用MTT的方法考察膠束對樹突狀細(xì)胞（DCs）、脾臟細(xì)胞（Spleen Cells）和293T細(xì)胞的安全性；并使用流式細(xì)胞儀和激光共

3、聚焦顯微鏡考察PO-CS膠束負(fù)載ProTα和siRNA進(jìn)入DCs的情況及聚合物膠束溫度敏感性的考察。利用Western Blot方法檢測負(fù)載STAT3膠束與TADCs共培養(yǎng)后STAT3蛋白的下調(diào)情況，同時使用流式細(xì)胞儀檢測STAT3-siRNA發(fā)揮沉默效果后，ProTα促進(jìn)TADCs表達(dá)CD40，CD86及IL-12的情況。采用IVIS Lumina II小動物成像儀觀察膠束負(fù)載Cy5-siRNA的體內(nèi)動態(tài)情況，使用紅外熱成像儀考察膠束

4、體內(nèi)冷刺激所需的時間。建立 B16黑色素瘤腫瘤模型考察負(fù)載 ProTα和STAT3-siRNA的ProTα-PO-CS載體的體內(nèi)藥效學(xué)效果。
　　結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建 PO-CS載體容易形成膠束，CMC較低（5.0μg/ml）。TEM結(jié)果表明，PO-CS膠束外觀圓整，粒徑為231.7±4.6nm，電位為17.3±0.3mV，PI值較小，對siRNA的包封率達(dá)90％以上，且具有一定的溫度敏感性。MTT結(jié)果顯示，PO-CS膠束的DCs細(xì)

5、胞毒性低，并且其負(fù)載的siRNA在樹突狀細(xì)胞中的攝?。?1%）要比巨噬細(xì)胞（25%）高。激光共聚焦顯微鏡結(jié)果表明，ProTα/PO-CS膠束能很好地將siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)到TADCs中，并且具有很好的溫度敏感性，能在冷刺激的作用下實(shí)現(xiàn)siRNA的釋放。Western Blot結(jié)果表明，膠束負(fù)載的STAT3-siRNA能有效沉默TADCs中STAT3蛋白的表達(dá)，并且能在流式細(xì)胞儀中觀察到ProTα促進(jìn)TADCs中表面成熟因子CD40，CD86的

6、上調(diào)，而未加 STAT3-siRNA處理組并無此功能。該結(jié)果表明共負(fù)載STAT3-siRNA和ProTα處理后，TADCs的功能得到恢復(fù)，能向成熟樹突狀細(xì)胞分化。IL-12因子的上調(diào)結(jié)果也證明經(jīng)共負(fù)載 STAT3-siRNA和 ProTα膠束治療后，TADCs恢復(fù)正常的功能。體內(nèi)小動物成像結(jié)果表明，膠束負(fù)載 siRNA后，持續(xù)長時間觀察到 Cy5-siRNA的體內(nèi)動態(tài)情況。紅外熱成像結(jié)果表明，體內(nèi)達(dá)到冷刺激效果溫度所需的時間為20-25

7、min。體內(nèi)腫瘤生長抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與PBS組相比，負(fù)載ProTα和STAT3-siRNA的ProTα-PO-CS冷刺激膠束組能很好地調(diào)控TADCs的功能，發(fā)揮免疫抗腫瘤效果，抑制腫瘤的生長，同時釋放更多的IL-12，共同抑制腫瘤的生長。
　　結(jié)論：ProTα-PO-CS溫度敏感性膠束能將siRNA遞送到TADCs中，沉默STAT3蛋白的表達(dá)，調(diào)控TADCs的功能，恢復(fù)ProTα促進(jìn)樹突狀細(xì)胞向成熟樹突狀細(xì)胞分化的功能，發(fā)揮聯(lián)合