Endo G基因在鎘誘導(dǎo)HEK-293細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、越來越多的研究表明，鎘可誘導(dǎo)HEK—293細(xì)胞發(fā)生凋亡并其凋亡依賴于線粒體途徑。弄清線粒體在細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制，對于研究細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制具有重要的理論意義。本研究通過構(gòu)建Endo G基因真核表達(dá)載體，研究Endo G基因在鎘誘導(dǎo)HEK—293細(xì)胞凋亡過程中的作用。
　　 1．Endo G在鎘處理HEK—293、WRL—68和HepG2細(xì)胞中表達(dá)量的分析
　　 每種細(xì)胞分別選擇兩個適當(dāng)?shù)穆然k濃度梯度處理，通過West

2、ern blot，分析比較Endo G蛋白在三種細(xì)胞中表達(dá)量的差異。結(jié)果顯示，在HEK—293、WRL—68和HepG2細(xì)胞中，Endo G表達(dá)量較多的細(xì)胞是HepG2，其次是WRL—68，較少的是HEK—293細(xì)胞。而且，隨著氯化鎘誘導(dǎo)濃度的增加，每種細(xì)胞中Endo G表達(dá)量呈遞減趨勢。
　　 2．pcDNA3．0—EndoG真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 從HepG2細(xì)胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA模板。根據(jù)Gen

3、Bank公布的人源Endo G基因序列設(shè)計引物，通過PCR方式擴(kuò)增基因，將基因和載體雙酶切后，通過T4連接酶將基因連到pcDNA3．0中，得到pcDNA3．0—EndoG真核表達(dá)載體。結(jié)果顯示，成功地構(gòu)建了含目的基因的真核表達(dá)載體pcDNA3．0—EndoG，為研究該基因在鎘誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　 3．Endo G基因在鎘誘導(dǎo)HEK—293細(xì)胞凋亡中的作用
　　 將真核表達(dá)載體pcDNA3．0—EndoG和

4、空載體pcDNA3．0分別與pcDNA3．0—GFP共轉(zhuǎn)染HEK—293細(xì)胞，用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染時間達(dá)32 h，采用Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)Endo G蛋白表達(dá)量。通過MTT、AO/EB以及流式細(xì)胞術(shù)檢測該基因與鎘對細(xì)胞成活率與凋亡率的影響，通過Real—time PCR檢測Endo G mRNA轉(zhuǎn)錄的變化。結(jié)果顯示，在HEK—293細(xì)胞成功表達(dá)了Endo G基因，隨著鎘處理濃度的增加，Endo G表達(dá)量出現(xiàn)先上升后下降的現(xiàn)象