克隆的BKCa通道在AngⅡ誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞增殖中的調(diào)控作用.pdf

1、BKCa通道是鉀離子通道的一種，其標(biāo)志性特征是能被細(xì)胞內(nèi)升高的Ca2+濃度和去極化協(xié)同激活。表達(dá)在不同組織細(xì)胞的BKCa通道參與許多生理功能的調(diào)控。BKCa通道以四聚體的形式存在，由形成孔道的功能性a亞基和不同的調(diào)節(jié)性β亞基組成，這就形成了BKCa通道的分子多樣性。BKCa通道的組織細(xì)胞及功能特異性與其不同β亞基構(gòu)成有關(guān)，比如，β1亞基在血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)分布豐富。BKCa通道對(duì)于VSMCs膜電位的維持與血管肌源性調(diào)節(jié)起著非常

2、重要的作用。此外，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)BKCa通道亦參與細(xì)胞增殖調(diào)控，尤其是在腫瘤細(xì)胞，但是關(guān)于BKCa通道在AngⅡ誘發(fā)VSMCs細(xì)胞增殖中的作用及其機(jī)制尚不清楚。
　　由于VSMCs膜上存在眾多的離子通道，它們之間相互影響，交互作用復(fù)雜，因而很難孤立地研究某一通道的功能特性。研究表明，HEK293細(xì)胞膜上存在的內(nèi)源性通道很少，因而作為一種有效的真核表達(dá)系統(tǒng)被廣泛地應(yīng)用于外源性離子通道的研究中。本課題研究目的是建立人BKCaa+b

3、1亞基/BKCaa亞基在HEK293細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)，并探討B(tài)KCa通道在AngⅡ誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞增殖過程中的調(diào)控作用。
　　方法：
　　1.1將克隆有人BKCa通道a亞基cDNA和b1亞基cDNA的重組質(zhì)粒pIRES-hSloa+b1/pIRES-hSloa轉(zhuǎn)化擴(kuò)增、提純后行酶切鑒定。
　　1.2.用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒和表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）的報(bào)告基因質(zhì)粒pEGFP共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。用熒光顯微鏡檢測(cè)報(bào)告基

4、因GFP的表達(dá)。
　　1.3.用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法觀察BKCab1亞基在HEK293-hSloa+b1細(xì)胞膜表面的表達(dá)定位；用蛋白印記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BKCaa及BKCab1亞基蛋白在HEK293-hSloa+b1細(xì)胞的表達(dá)。
　　1.4.用膜片鉗技術(shù)記錄轉(zhuǎn)染細(xì)胞BKCa通道的單通道電流，分析其動(dòng)力學(xué)、藥理學(xué)特性。
　　2.1.通過MTT法測(cè)定AngⅡ誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染的HEK293-hSloa+b1/HEK293-hSloa細(xì)胞生長

5、的量效曲線及時(shí)效曲線。
　　2.2.用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)觀察AngⅡ，IbTX，AngⅡ+IbTX，AngⅡ+TEA及NS1619對(duì)HEK293-hSloa+b1/HEK293-hSloa細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）表達(dá)的影響。
　　2.3.用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)AngⅡ，IbTX，AngⅡ+IbTX，AngⅡ+TEA及NS1619對(duì)HEK293-hSloa+b1/HEK293-hSloa細(xì)胞周期的影響。
　　結(jié)果

6、：
　　1.1.重組質(zhì)粒pIRES-hSloa+b1/pIRES-hSloa擴(kuò)增后，目的基因片段沒有丟失并且成功插入載體的相應(yīng)位點(diǎn)；與pEGFP共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，報(bào)告基因GFP高效表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色證實(shí)轉(zhuǎn)染后的HEK293細(xì)胞形態(tài)良好，在HEK293-hSloa+b1細(xì)胞膜表面有BKCab1亞基的表達(dá)，蛋白印記實(shí)驗(yàn)表明在HEK293-hSloa+b1細(xì)胞BKCaa及BKCab1亞基蛋白表達(dá)陽性。
　　1.2.通過

7、膜片鉗技術(shù)在HEK293-hSloa+b1細(xì)胞記錄到外源性BKCa通道電流。通道的開放呈現(xiàn)電壓依賴性及Ca2+敏感性；電流-電壓關(guān)系呈線性，單通道電導(dǎo)為151±7pS；BKCa通道特異性激動(dòng)劑NS1619對(duì)通道具有激活作用，而BKCa通道特異性阻斷劑IbTX對(duì)通道具有阻斷作用。
　　2.1.AngⅡ可濃度依賴性、時(shí)間依賴性地誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染的HEK293-hSloa+b1/HEK293-hSloa細(xì)胞增殖。AngⅡ（100nmol/L）可

8、顯著增加轉(zhuǎn)染細(xì)胞PCNA的陽性表達(dá)率，BKCa通道阻斷劑IbTX及TEA可顯著降低AngⅡ誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞PCNA陽性表達(dá)。
　　2.2.FCM檢測(cè)結(jié)果表明AngⅡ可誘導(dǎo)HEK293-hSloa+b1/HEK293-hSloa細(xì)胞S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增加，IbTX可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的G1期細(xì)胞向S期的轉(zhuǎn)換，并且明顯降低了G2細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，從而阻滯細(xì)胞的有絲分裂。
　　結(jié)論：
　　本研究將克隆有人BKCa通道a+b1亞基/a亞基

9、cDNA的重組質(zhì)粒pIRES-hSloa+b1/pIRES-hSloa轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞，通過免疫細(xì)胞化學(xué)、蛋白印記、膜片鉗等方法證實(shí)了人BKCaa+b1/a亞基在HEK293細(xì)胞的功能性表達(dá)，獲得高效表達(dá)人BKCaa+b1/a亞基的真核表達(dá)系統(tǒng)；通過免疫細(xì)胞化學(xué)、FCM、藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)等方法首次探討并證實(shí)了BKCa通道介導(dǎo)調(diào)控了AngⅡ誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞增殖。為進(jìn)一步闡明BKCa通道介導(dǎo)調(diào)控AngⅡ誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞增殖過程中的