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文檔簡介
1、第一章ChIP-seq數(shù)據(jù)分析P300在乳腺癌細胞中的結(jié)合位點
目的:為了揭示雌二醇(estrogen, E2)刺激前后乳腺癌細胞MCF7中P300結(jié)合位點的分布特征,篩選受雌激素受體信號激活的P300調(diào)控基因,確定P300及其調(diào)控基因在乳腺癌中的相關(guān)作用機制。
方法:以E2刺激前后人類乳腺癌細胞MCF7中P300增強子結(jié)合蛋白的ChIP-seq數(shù)據(jù)(GSE39623)為基礎(chǔ),首先分析了E2刺激前后P300結(jié)合位點在
2、染色體上的分布情況,以及結(jié)合位點信號變化的差異。通過對P300結(jié)合位點周圍基因的檢測,對P300調(diào)控的靶基因進行了分析,進而結(jié)合GO數(shù)據(jù)庫對這些靶基因進行了功能富集分析。此外,我們還確定了E2刺激前后與P300結(jié)合信號顯著增強的特異性靶基因,并同時進行了GO功能富集分析。最后我們分別對E2刺激前后特異性的P300結(jié)合位點進行了Motif finding分析,并對E2刺激后新出現(xiàn)能夠與P300發(fā)生共定位的轉(zhuǎn)錄因子進行了GO功能富集分析。<
3、br> 結(jié)果:乳腺癌細胞MCF7中P300的結(jié)合位點主要集中在5’ UTR區(qū)域、3’ UTR區(qū)域、轉(zhuǎn)錄起始位點和轉(zhuǎn)錄終止位點兩側(cè),而E2刺激后P300結(jié)合位點在TSS區(qū)域的分布密度出現(xiàn)少量上升。在E2刺激后確定的24899個差異P300結(jié)合位點中,39%位點的結(jié)合信號顯著上升。E2刺激前 P300調(diào)控的靶基因主要富集在與神經(jīng)細胞分化相關(guān)的生物學(xué)過程,而E2刺激后富集在細胞連接、細胞粘附等過程的靶基因顯著增多。此外,針對結(jié)合信號顯著增強
4、的P300調(diào)控靶基因功能富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩組靶基因均與神經(jīng)分化的功能相關(guān),而E2刺激后細胞運動功能出現(xiàn)了大量基因的富集。最后,我們在E2刺激前后P300結(jié)合位點周圍分別找到了225和176個Motif富集顯著水平較高的轉(zhuǎn)錄因子。功能富集分析結(jié)果顯示P300共定位轉(zhuǎn)錄因子主要富集在細胞增殖、分化、遷移等生物學(xué)過程。此外我們發(fā)現(xiàn)雌激素受體信號通路相關(guān)因子ESR1、BRCA1也能夠與P300發(fā)生共定位。
結(jié)論:P300在乳腺癌中發(fā)
5、揮了廣泛的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,并與雌激素受體信號通路之間存在明顯的相關(guān)性。
第二章PAX6和P300在人乳腺癌細胞和組織中的表達
目的:為了揭示P300和PAX6在人乳腺癌細胞及組織中的表達情況。
方法:本研究首先采用定量PCR的方法檢測了PAX6及P300在人乳腺上皮細胞株HBL-100,人乳腺癌細胞株BT-474、MDA-MB-231、MCF-7中的表達水平。進而通過收集經(jīng)手術(shù)切除臨床雌激素受體陽性淋巴轉(zhuǎn)移人
6、乳腺癌組織樣本30例,雌激素受體陽性無轉(zhuǎn)移人乳腺癌組織樣本30例以及相應(yīng)的癌旁組織(非癌組織),同樣采用定量 PCR的方法檢測了PAX6及P300在這些組織中的表達水平。
結(jié)果:PAX6在人乳腺癌細胞系BT-474中高表達,而相對的乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7中的表達較低(P<0.01)。P300則在三種乳腺癌細胞系中高表達(P<0.01)。P300和PAX6在癌旁組織(非癌組織)中的表達低于相應(yīng)的癌組織(P<
7、0.05),且轉(zhuǎn)移乳腺癌組織樣本中P300和PAX6的表達明顯高于非轉(zhuǎn)移乳腺癌組織(P<0.05)。
結(jié)論:PAX6和P300在乳腺癌中均高表達,且與乳腺癌的轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。
第三章P300基因敲除對乳腺癌細胞增殖、侵襲、遷移能力的影響。
目的:為了揭示P300對乳腺癌細胞MCF-7增殖、凋亡、侵襲及遷移能力的影響。
方法:本研究通過化學(xué)合成構(gòu)建了3組 siRNA片段(siP300-1, siP30
8、0-2及siP300-3)用于P300的沉默。轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞MCF-7后,我們首先通過定量PCR檢測了該3組片段對P300的沉默效率,以及對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP9、VEGF和uPA表達的影響。接著通過Western blot驗證了siP300-1對P300以及PAX6表達的影響。隨后通過CCK-8、流式細胞儀檢測了三組片段對乳腺癌細胞MCF-7增殖及凋亡的影響,并通過劃痕實驗以及Transwell侵襲實驗檢測了siP300-1對乳
9、腺癌細胞MCF-7侵襲及遷移能力的影響。
結(jié)果:siP300-1,siP300-2及siP300-3都可以明顯抑制乳腺癌細胞MCF-7中 P300的表達,但各組 siRNA的抑制效果有所不同。siRNA轉(zhuǎn)染3天后,siP300-1,siP300-2及siP300-3均表現(xiàn)出明顯抑制MCF-7細胞活性的能力(P<0.05)。siRNA處理2天后,NC、siP300-1、siP300-2及siP300-3組細胞的凋亡率分別為18.
10、22%、18.60%、21.94%、17.94%,組間無顯著差異。P300沉默后,腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移基因MMP9、VEGF和uPA的表達明顯受到抑制(P<0.05),并且明顯減緩的愈合程度以及減少的細胞數(shù)目都進一步說明了乳腺癌細胞MCF-7的侵襲及遷移能力受到了抑制。此外乳腺癌細胞系MCF-7中PAX6的表達也受到了siP300-1的抑制。
結(jié)論:siRNA可以有效的抑制乳腺癌細胞MCF-7中P300的表達,并進而抑制乳腺癌細胞MC
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