基于AlphaLISA技術(shù)檢測胰島素樣生長因子1受體與其相關(guān)通路蛋白相互作用方法的建立.pdf

1、目的：
　　人類探索生命奧秘的腳步一直都沒有停止，自胡克發(fā)現(xiàn)細(xì)胞后，人們開始從微觀方向開始研究生命，而DNA的發(fā)現(xiàn)是探索生命的里程碑，有人預(yù)測，如果將人類的基因組全部測出，我們就能了解生命，解釋生命。人類基因組計(jì)劃(human genome project，HGP)是由美國科學(xué)家于1985年率先提出，于1990年正式啟動的，人類開始進(jìn)一步探索生命的執(zhí)行者——蛋白質(zhì)。國際人類蛋白質(zhì)組計(jì)劃(HPP)是繼國際人類基因組計(jì)劃之后的又一項(xiàng)大

2、規(guī)模的國際性科技工程。我國承擔(dān)了圍繞人類肝臟蛋白質(zhì)組的表達(dá)譜、修飾譜及其相互作用的連鎖圖等九大科研任務(wù)。
　　目前，探索蛋白質(zhì)相互作用的方法主要包括酵母雙雜交，噬菌體展示，免疫共沉淀，Pull-down等。這些方法都是目前認(rèn)為的鑒定蛋白質(zhì)相互作用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，但是這些方法程序繁瑣，花費(fèi)時間多，且影響因素較多。本實(shí)驗(yàn)希望能夠發(fā)現(xiàn)檢測蛋白質(zhì)的相互作用的新方法，具有快速，準(zhǔn)確的檢測。
　　快速準(zhǔn)確的檢測方法有很多，而標(biāo)記免疫學(xué)是目前

3、運(yùn)用最多，最廣也是探索較多的方法學(xué)。標(biāo)記免疫技術(shù)具有快速檢測、特異性高、高通量檢測等優(yōu)勢。在醫(yī)院各種疾病的檢測多用標(biāo)記免疫學(xué)方法，比如癌癥蛋白AFP、CEA的檢測，乙肝表面抗原及抗體的檢測，血液中蛋白含量的檢測等。標(biāo)記免疫技術(shù)也用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)，標(biāo)記免疫技術(shù)也各有其優(yōu)缺點(diǎn)，ELISA中，標(biāo)記的辣根過氧化物酶比較容易失活，還有可能受抗原抗體空間位阻的影響導(dǎo)致其靈敏度受到限制;CLIA方法缺點(diǎn)就是影響因素過多，例如CLIA方法容易受到外界環(huán)境的

4、干擾使其只能用于非開放性檢測，使用原料多為進(jìn)口價格昂貴，最重要的是樣品無法重復(fù)測量;TRFIA、ECLIA方法是CLIA方法的改進(jìn)，但是原料依然較高且為封閉性檢測;以上技術(shù)程序繁瑣且需要洗滌。因此，許多運(yùn)用新理論新技術(shù)的標(biāo)記免疫技術(shù)應(yīng)運(yùn)而上。其中，光激化學(xué)發(fā)光免疫分析(Amplified luminescent proximity homogenous assay，AlphaLISA)技術(shù)就是其一，也是本實(shí)驗(yàn)主要的檢測技術(shù)。AlphaL

5、ISA工作原理是運(yùn)用抗原抗體的特異性結(jié)合及光激化學(xué)發(fā)光技術(shù)。使用這種檢測方法用于檢測蛋白質(zhì)相互作用的優(yōu)勢是使用的樣品量比之傳統(tǒng)方法要少，檢測的時間較短，并且能夠進(jìn)行大量樣品的檢測。
　　胰島素樣生長因子受體1(Insμ Lin like growth factor type1，IGF-1R)全長1366個氨基酸，其三維結(jié)構(gòu)是由兩條IGF1R蛋白，每個蛋白在蛋白酶的作用下分成α和β段，最終形成一個四聚體結(jié)構(gòu)。IGF1R參與了多個生理

6、反應(yīng):外分泌胰腺發(fā)育;乳腺發(fā)育;男性的性別決定;免疫應(yīng)答;大腦發(fā)育;胰島素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;細(xì)胞增殖正調(diào)控;有絲分裂的正調(diào)控;轉(zhuǎn)錄因子活性的負(fù)調(diào)控;細(xì)胞凋亡等;
　　有關(guān)報(bào)道，IGF1R與Csk、SOCS1存在相互作用。C-Src蛋白酪氨酸激酶(C-Src tyrosine kinase，Csk)是Src激酶家族(SFKs)的成員，為SFKs的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白。Csk是非受體酪氨酸激酶，需要跨膜受體如IGF1受體，EGF受體，T細(xì)胞受體

7、或跨膜銜接蛋白如CBP等的幫助完成信號傳遞。推測Csk發(fā)揮功能與其同這些蛋白的相互作用有關(guān)。SOCS1是細(xì)胞因子信號(SOCS)蛋白家族抑制器的一個成員，SOCS1成為腫瘤的研究熱點(diǎn)。在某些腫瘤，SOCS1表達(dá)，SOCS1基因甲基化，突變和缺失下降。SOCS1已經(jīng)在許多癌癥中，例如結(jié)腸直腸癌，乳腺癌，肝癌發(fā)揮了重要的作用。
　　IGF1R與多種不同蛋白的相互作用使其發(fā)揮不同的功能，因此研究不同生理病理過程中IGFR的蛋白相互作用非

8、常重要。我們希望通過一種新的方法來研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。
　　方法：
　　采用雙抗體夾心法研制IGF1R與蛋白Csk、SOCS1等的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析法。
　　1.制備IGF1R抗體的原料制備:
　　提取Hela細(xì)胞的RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA。使用Primer5軟件、pMal-c2x載體圖譜及GenBank中IGF1R基因序列(NM001291858)設(shè)計(jì)IGF1R蛋白的β段引物，在下游引物

9、上加入6個his標(biāo)簽，并在引物兩端加入BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。通過PCR得到目的基因。將pMal-c2x載體同獲得的PCR產(chǎn)物同時進(jìn)行BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)入到TOP10感受態(tài)中。使用酶切和測序鑒定重組質(zhì)粒是否成功。
　　將鑒定重組成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到BL21感受態(tài)中，通過改變誘導(dǎo)的溫度及誘導(dǎo)劑IPTG濃度獲得最佳表達(dá)條件。按照最佳表達(dá)條件進(jìn)行大量表達(dá)。收集誘導(dǎo)后的細(xì)菌重懸、反復(fù)凍融、超聲破碎

10、、高速低溫離心等，得到表達(dá)上清，通過SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色進(jìn)行表達(dá)鑒定。將上清分別經(jīng)過AmyloseResin和鎳柱進(jìn)行親和層析純化，通過SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色進(jìn)行純化結(jié)果鑒定，比較兩種純化方法的優(yōu)劣。并最終得到純化的蛋白，送廣州瑞博奧進(jìn)行抗體制備。
　　2、IGF1R、Csk、SOCS1等蛋白的真核表達(dá)，及相互作用的鑒定
　　提取Hela細(xì)胞的RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA。使用Primer5軟件、p

11、CNDA、pENTER載體圖譜及GenBank中基因序列分別設(shè)計(jì)IGF1R蛋白的β段，IGF1R全長，IGF1R-α,Csk,SOCS1,FAK,IGF1,IGFBP3,GRB10,SHC1的引物，并在引物兩端加入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。通過PCR得到目的基因。割膠回收后，將pCDNA、pENTER載體同獲得的PCR產(chǎn)物同時進(jìn)行雙酶切，割膠回收酶切產(chǎn)物，酶切后的目的片段與載體按照7∶1質(zhì)量比通過T4DNA連接酶進(jìn)行連接后，轉(zhuǎn)入到TOP

12、10感受態(tài)中，將細(xì)菌涂板。12h后挑去單克隆的菌落，搖菌提取重組質(zhì)粒。使用酶切和測序鑒定重組質(zhì)粒是否成功。
　　將鑒定重組成功的重組載體通過脂質(zhì)載體轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染到293T中進(jìn)行真核表達(dá)，通過Westemblot及免疫熒光定位鑒定蛋白是否表達(dá)。
　　參考文獻(xiàn)及獲得抗體的難易程度，我們首先選擇檢測IGF1R與SOCS1，IGF1R與Csk的相互作用。
　　將重組表達(dá)成功的IGF1R-β-pENTER分別與Csk-pENT

13、ER，SOCS1-pENTER共轉(zhuǎn)染與293T細(xì)胞中，通過Westemblot鑒定共表達(dá)效果。并通過改變IGF1 R-β-pENTER與Csk-pENTER, SOCS1-pENTER共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒比例達(dá)到表達(dá)的IGF1R與Csk蛋白，IGF1R和SOCS1蛋白表達(dá)量達(dá)到1∶1。
　　使用COIP及熒光共定位的方法鑒定IGF1R與Csk、SOCS1的相互作用。
　　3、初步建立IGF1R與Csk、SOCS1相互作用檢測反應(yīng)體系

14、及反應(yīng)條件摸索
　　使用已經(jīng)在化學(xué)發(fā)光檢測體系建立了比較完整的AFP抗原和配對的AFP抗體，建立光激化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測體系。使用硼氰基化鈉化學(xué)連接法將發(fā)光微球與AFP抗體1連接，AFP抗體2進(jìn)行生物素化。通過改變發(fā)光微球與AFP抗體1連接的比例，生物素抗體的使用量，不同緩沖液的使用等條件，篩選最適合的反應(yīng)條件。
　　結(jié)果：
　　成功將IGF1 R-β-pMal-c2x原核表達(dá)載體重組構(gòu)建成功，并在大腸桿菌中成功表達(dá)。

15、通過鎳柱親和層析，純化出制作單克隆抗體的原料。
　　成功構(gòu)建IGF1R-pCDNA4.0、IGF1R-β-pENTER、IGF1R-α-pCDNA3.1、Csk-pENTER、SOCS1-pENTER、IGF1-pENTER、IGFBP3-pENTER、FAK-pENTER、GRB10-pENTER、SHC1-pENTER等真核表達(dá)載體并在293T中得到表達(dá)。
　　將IGF1R-β-pENTER與Csk-pENTER進(jìn)行共轉(zhuǎn)

16、染表達(dá)，IGF1 R-β-pENTER與SOCS1-pENTER進(jìn)行共轉(zhuǎn)染表達(dá)成功。通過COIP和熒光共定位鑒定IGF1R與Csk、SOCS1的相互作用。
　　通過摸索AFP反應(yīng)模式，摸索光激化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測技術(shù)，發(fā)現(xiàn)使用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液優(yōu)于PBS緩沖液，生物素化抗體使用最合適的濃度為0.125μg/孔。發(fā)光微球與抗體的連接質(zhì)量比例為20∶3，發(fā)光微球使用濃度為2.5μ g/孔。
　　通過建立的檢測體系檢測IGF1R與Csk的

17、相互作用，可以發(fā)現(xiàn)隨著蛋白濃度的升高，熒光值升高，且程線性關(guān)系，R2=0.9968。檢測IGF1R與SOCS1的相互作用，可以發(fā)現(xiàn)隨著蛋白濃度的升高，熒光值升高，且程線性關(guān)系，R2=0.9983.
　　結(jié)論：
　　上述結(jié)果表明本研究建立的檢測蛋白質(zhì)相互作用光激化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測方法成功，能夠檢測到IGF1R與Csk，IGF1R與SOCS1，IGF1R與各通路蛋白之間的相互作用。該方法可用于其它細(xì)胞中相互作用的檢測，例如He

18、p3，HFF-1等細(xì)胞系。
　　這種檢測方法相比于其它方法的優(yōu)點(diǎn)有:1）使用的樣品較少:AlphaLISA使用的樣品600ng即可約1μL的細(xì)胞裂解液。2）檢測時間較少:AlphaLISA檢測時間為30min到2h，一般30min即可檢測到結(jié)果。3）步驟較少:AlphaLISA步驟只有兩步即加樣和檢測。4）檢測樣品較多:AlphaLISA一次性可以檢測96個孔甚至288個，檢測的樣品較多。5）檢測的靈敏度較高:AlphaLISA可