SIRT1-Wnt-β-catenin信號通路在糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展過程中的變化及奧美沙坦酯的干預(yù)作用研究.pdf

1、研究目的：糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病（diabetes mellitus， DM）心血管并發(fā)癥中一種獨立、特異的心肌病，與糖尿病患者發(fā)生心力衰竭和死亡率升高密切相關(guān)，是DM患者死亡的主要原因。本課題通過建立2型糖尿病大鼠模型，研究DCM發(fā)生發(fā)展過程中大鼠心肌SIRT1/Wnt/β-catenin信號通路的變化，探討其可能的調(diào)節(jié)機制，并通過奧美沙坦酯的干預(yù)作用來研究ARB類藥物的心肌保護

2、作用，旨在完善DCM的病理生理及調(diào)控機制，探究DCM的藥物治療，為DCM的治療尋找新的治療靶點。
　　研究方法：
　　1.模型建立
　　按體重均衡的原則將250只SD大鼠隨機分為非糖尿病組（non-diabetic，ND group），糖尿病模型組（DM group）。ND組始終飼以普通飲食，DM組采用高脂流質(zhì)灌胃，兩組動物均自由飲水。5周后，DM組大鼠禁食12 h，頸靜脈竇取血檢測血清總膽固醇（total chole

3、sterol，TC）,甘油三酯（triglyceride，TG）等生化指標，選擇高脂模型成功大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素造模，72 h尾靜脈采血檢測空腹血糖值（fasting blood glucose， FBG），以FBG≥11.1 mmol/L，胰島素敏感指數(shù)降低，認為2型糖尿病大鼠模型成功。2.2型糖尿病大鼠心肌SIRT1/Wnt/β-catenin信號通路的變化研究
　　（1）實驗分組：
　　按照體重均衡的原則，將造模成功

4、的DM組大鼠隨機分為2，4，8和12周組，每組8只，維持高脂灌胃，直到實驗所設(shè)計的時間點?？瞻讓φ战M常規(guī)正常飲食。
　　（2）研究過程：
　?、?血生化檢測血清FBG、TG、TC、HD-C、LDL-C水平；
　?、?超聲心動圖檢測心功能改變，記錄分析LVIDd、LVIDs、LVPWd、LVPWs、LV Mass、FS、LVEF、LVMass/BodyWeight變化情況；
　?、? ELISA法檢測空腹血漿胰島素

5、（FINS）、血清CTnI水平；
　?、? HE染色法觀察大鼠心肌組織病理改變；
　?、?免疫組織化學(xué)法（immunohistochemical，IHC）檢測大鼠心肌Wnt2、β-catenin、c-Myc、sFRP2、Dact1及SIRT1的蛋白表達情況；
　?、? Western blotting（WB）檢測大鼠心肌Wnt2、β-catenin、c-Myc、TCF4、DKK1、sFRP2、Dact1、SIRT1及A

6、T1-R蛋白表達變化；
　?、? RT-PCR檢測相關(guān)基因mRNA的表達變化。
　　3.奧美沙坦酯對2型糖尿病大鼠心肌SIRT1/Wnt/β-catenin信號通路的干預(yù)作用
　?。?）實驗分組：
　　將造模成功的DM組大鼠隨機分為2，4，8和12周組，每組再分為DM模型組，奧美沙坦酯（Olmesartan Medoxomil, OLM）干預(yù)組（高、中、低劑量組），達美康組（Diamicron, DIA），聯(lián)合用

7、藥組（OLM+DIA），每組10只。
　　（2）研究過程：
　?、?血生化檢測血清FBG、TG、TC、HD-C、LDL-C水平；
　?、?超聲心動圖檢測心功能改變，記錄分析LVIDd、LVIDs、LVPWd、LVPWs、LV Mass、FS、LVEF、LVMass/BodyWeight變化情況；
　?、? ELISA法檢測空腹血漿胰島素（FINS）及血清Ang II水平；
　?、? HE染色法觀察大鼠心肌組

8、織病理改變；
　?、? Western blotting（WB）檢測大鼠心肌Wnt2、β-catenin、c-Myc、TCF4、DKK1、sFRP2、Dact1、SIRT1及AT1-R蛋白表達變化；
　　實驗結(jié)果：
　　1.糖尿病大鼠一般狀況及組織病理學(xué)改變
　　與ND組比較，DM組大鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多食、多尿和消瘦，精神萎靡，皮毛無光澤，腥臊酮臭味加重、稀便等。其中，DM模型中35只大鼠血糖出現(xiàn)自愈現(xiàn)象，18只

9、大鼠因灌胃不當出現(xiàn)嚴重肺部感染，被剔除出實驗，實驗造模成功大鼠197只，成功率為率78.8％。DM組大鼠FBG明顯升高，F(xiàn)INS水平、HW及LVW均明顯降低，BWI及LVWI均高于ND組。血清FBG、TG、TC、LDL-C明顯升高。超聲心動圖數(shù)據(jù)顯示， LVIDd及LVIDs值顯著增大，F(xiàn)S、LVEF及LV Mass值顯著降低。HE結(jié)果顯示，2周DM組大鼠心肌無明顯變化，4周出現(xiàn)炎性浸潤，局灶性心肌細胞變性，但未觀察到明顯的心肌肥大。8

10、、12周時DM組大鼠出現(xiàn)心肌膠原沉積，甚至壞死，心肌纖維化及心肌肥大。與DM模型組比較，OLM干預(yù)組大鼠超聲心動數(shù)據(jù)顯示心功能指標有所改善，心肌病理觀察也顯示病變有所減輕，OLM聯(lián)合DIA組與單獨OLM干預(yù)組比較無顯著性差異。
　　2.2、型糖尿病大鼠心肌SIRT1/Wnt/β-catenin信號通路的變化研究
　　WB及定量PCR實驗結(jié)果表明，與正常對照組大鼠相比較，糖尿病組大鼠心肌Wnt2、β-catenin及下游P-G

11、SK3β的表達在2 wk及4 wk顯著增加（P<0.01），4 wk后維持在較高水平，8 wk及12 wk表達變化無顯著性差異（P>0.05）；糖尿病大鼠從2 wk到12 wk過程中，TCF4、SIRT1蛋白表達與正常對照組相比表現(xiàn)為持續(xù)增加（P<0.05），sFRP2蛋白的表達持續(xù)降低（P<0.01），但DKK1的表達變化不明顯。IHC結(jié)果顯示，DM組大鼠心肌中Wnt2、β-catenin的表達均明顯增加，其中β-catenin伴隨少

12、量核表達。
　　3.奧美沙坦酯對2型糖尿病大鼠心肌SIRT1/Wnt/β-catenin信號通路的干預(yù)作用
　　WB實驗結(jié)果表明，與糖尿病模型組相比較，OLM干預(yù)各劑量組心肌組織Wnt2、β-catenin及SIRT1蛋白的表達均顯著降低，OLM中劑量降低最顯著；DIA組上述蛋白表達變化不大，而OLM聯(lián)合DIA干預(yù)作用與OLM單獨作用未見顯著性區(qū)別。與DM模型組Ang II水平顯著升高及AT1-R降低相比較，OLM組能顯著降

13、低血清Ang II水平，增加AT1-R蛋白表達；而DIA組Ang II及AT1-R蛋白表達水平無顯著變化。
　　結(jié)論：
　　1.高脂飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的大鼠DM成模后，隨著糖尿病的發(fā)生發(fā)展，伴隨著胰島素抵抗，心功能有逐漸降低的趨勢，心肌細胞凋亡增加，伴隨明顯的心肌細胞壞死、心肌肥大和心肌纖維化等心肌損傷。
　　2.在DCM的發(fā)生發(fā)展過程中，隨著DM模型大鼠心肌SIRT1表達降低，受其調(diào)節(jié)的下游因子sFRP2及Dact1