RhoA-Rho激酶信號通路在心肌肥厚及糖尿病心肌病中的作用研究.pdf

1、心肌肥厚是多種心血管病的共同病理結(jié)局，其主要特征是細胞體積增大、蛋白合成增加、胚胎型基因表達上調(diào)。早期的心肌肥厚可能是心肌細胞對內(nèi)外界刺激的一種適應(yīng)性改變，有一定的代償意義，有利于維持心輸出量，但持續(xù)的心肌肥厚最終會不可避免地導(dǎo)致心力衰竭，甚至猝死。因此，探明心肌肥厚信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而有效的預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌肥厚具有重要的意義。
　　 心肌肥厚是肥大刺激誘導(dǎo)核內(nèi)基因異常表達的結(jié)果，細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是肥大刺激與核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄活化的偶聯(lián)

2、環(huán)節(jié)。然而，不同刺激誘導(dǎo)的心肌肥大可能具有不同的“分子表型”，這主要取決于它們啟動的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。對心肌肥大信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的深入認識，不僅有助于闡明心肌肥厚的細胞分子機制，而且可為藥物干預(yù)防治心肌肥厚提供新思路。
　　 RhoA/Rho激酶信號通路介導(dǎo)了多種細胞功能，包括細胞的收縮、細胞的粘附與遷移、細胞的增殖與凋亡等。而這些效應(yīng)與l臨床上多種心血管疾病如高血壓、再狹窄、動脈粥樣硬化、肺動脈高壓、腦血管痙攣、血管瘤、缺血再灌注損傷

3、的發(fā)生有關(guān)。因此RhoA/Rho激酶信號通路在心血管疾病的發(fā)病中起著重要作用。近年來有關(guān)RhoA/Rho激酶信號通路與自發(fā)性高血壓、壓力超負荷、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）所導(dǎo)致的心肌肥大的關(guān)系雖然已有一些報道，但是，到目前為止，還沒有研究能夠闡明抑制Rho激酶對異丙腎上腺素（Iso）誘發(fā)的心肌肥大以及糖尿病所誘發(fā)的心肌病的影響。
　　 本實驗以Rho激酶抑制藥法舒地爾（Fas）為工具藥，研究了：（1）RhoA/Rho激酶信號通路在

4、Iso誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚中的作用；（2）RhoA/Rho激酶信號通路對苯腎上腺素（PE）、Iso和AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大的影響；（3）RhoA/Rho激酶信號通路對鏈脲佐菌素（STZ）糖尿病心肌病的影響。
　　 第一部分 RhoA/Rho激酶信號通路在Iso誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚中的作用
　　 目的：研究RhoA/Rho激酶信號通路在Iso誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚中的作用。
　　 方法：清潔級雄性Wistar大鼠40只

5、，體重200～220 g，隨機分成5組：空白對照組、Iso模型組、Fas低劑量組、Fas高劑量組及卡托普利（captopril，Cap）組，每組8只。除空白對照組外，其余各組大鼠背部皮下注射Iso5 mg·kg-1·d-1，連續(xù)7 d。給Iso同時，F(xiàn)as低、高劑量組分別給予Fas2、10 mg·kg-1·d-1，分兩次腹腔注射給藥；Cap組給予Cap30mg·kg-1·d-1，灌胃；Iso組、空A對照組給予等容積生理鹽水。停藥24 h

6、后，測定下列指標：（1）血流動力學(xué)：包括心率（HR）、左室收縮壓（LVSP）、左室舒張末壓（LVEDP）、左室內(nèi)壓最大上升速率（+dp/dtmax）、左室內(nèi)壓最大下降速率（-dp/dtmax）等；（2）血液生化：經(jīng)頸總動脈取血，測定AngⅡ、丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脫氫酶（LDH）和肌酸激酶（CK）的活性；（3）心臟重量指數(shù)（HWI）；（4）病理形態(tài)學(xué)：觀察心肌的病理學(xué)改變并測量心肌細胞直徑（CMD）和心肌膠

7、原容積分數(shù)（CVF）；（5）RT-PCR測定RhoA、Rho激酶mRNA的表達。
　　 小結(jié)：Iso誘導(dǎo)的心肌肥厚的發(fā)病過程中，伴有RhoA/Rho激酶信號通路的激活；Fas可抑制該通路的激活，改善Iso誘導(dǎo)的心肌肥厚的心肌病理變化及心臟功能。Fas可以抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，提高機體抗氧化能力，發(fā)揮對心肌的保護作用。
　　 第二部分 RhoA/Rho激酶信號通路對PE、Iso和AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大的影響
　　

8、 目的：研究RhoA/Rho激酶信號通路對PE、Iso和AngⅡ所致大鼠心肌肥大的影響。
　　 方法：用消化法分離并培養(yǎng)新生大鼠的心肌細胞，隨機分為8組：空白對照組，F(xiàn)as對照組（Fas10-5mol·L-1），Iso組（Iso10-5mol·L-1）Iso+Fas組（Iso10-5mol·L-1+Fas10-5mol·L-1），AngⅡ組（AngⅡ10-7mol·L-），AngⅡ+Fas組（AngⅡ10-7mol·L-1+Fa

9、s10-5mol·L-1），PE組（PE10-5mol·L-1）PE+Fas組（PE10-5mol·L-1+Fas10-5mol·L-1）。Simpson法測各組心肌細胞大小，Lowrys法測心肌細胞蛋白質(zhì)含量，RT-PCR測定RhoA/Rho激酶mRNA表達，Western blot測定c-fos蛋白的表達。采用鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CaN）試劑盒檢測CaN的活性，李田昌等的方法檢測絲裂素活化蛋白激酶（M_APK）的活性。
　　 小

10、結(jié)：RhoA/Rho激酶通路參與了PE、AngⅡ所致大鼠心肌細胞肥大，Rho激酶抑制劑Fas通過抑制該通路的激活，抑制c-fos蛋白的表達，改善PE、AngⅡ所致大鼠心肌細胞肥大，而與CaN通路、MAPK通路無關(guān)。Iso所致大鼠心肌細胞肥大不伴有RhoA/Rho激酶通路的激活。
　　 第三部分 RhoA/Rho激酶信號通路對大鼠STZ糖尿病心肌病的影響
　　 目的：研究RhoA/Rho激酶信號通路對大鼠STZ糖尿病心肌病

11、的影響。
　　 方法：清潔級雄性Wistar大鼠50只，體重200～250 g，禁食不禁水12 h后，一次性尾靜脈注射0.3％的STZ溶液60 mg·kg-1；篩選血糖≥16.7mmol·L-1為糖尿病大鼠，隨機分成3組：STZ模型組（n=11）、Fas組（n=11）及Cap組（n=10）。另外10只給予等容積緩沖液（0.1 mol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液，pH4.5）設(shè)為空白對照組。飼養(yǎng)至給藥8 W后，各組分別給予干預(yù)藥物：

12、Fas組給予Fas10 mg·kg-1·d-1分兩次腹腔注射；Cap組給予Cap30 mg·kg-1·d-1分兩次灌胃給藥；空白對照組和STZ模型組腹腔注射等容積的生理鹽水；給藥持續(xù)4 w。給藥期間密切觀察各組大鼠活動、進食、飲水、大小便等一般情況，在給藥前及給藥后每2 W測體重及血糖一次。停藥24 h后，測定下列指標：（1）血流動力學(xué)：包括HR、LVSP、LVEDP和±dp/dtmax；（2）血液生化：測定AngⅡ、MDA含量及SOD

13、、LDH、CK活性；（3）HWI；（4）病理形態(tài)學(xué)：觀察心肌的病理學(xué)改變并測量CMD和CVF；（5）RT-PCR測定RhoA，Rho激酶mRNA的表達；（6）Western blot測定心肌組織Bax、Bcl-2蛋白表達。
　　 小結(jié)：在糖尿病心肌病的發(fā)病過程中，伴有RhoA/Rho激酶信號通路的激活；Fas可抑制該通路的激活，改善了糖尿病心肌病的心肌病理變化及心臟功能，延緩了向心力衰竭的發(fā)展；其機制可能與抑制AngⅡ/Gq/R

14、hoA/Rho激酶信號途徑，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，提高機體抗氧化能力，調(diào)節(jié)凋亡基因的表達有關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.RhoA/Rho激酶信號通路參與了Iso誘導(dǎo)的心肌肥厚的發(fā)病過程；Rho激酶抑制劑Fas可抑制該通路的激活，改善Iso誘導(dǎo)的心肌肥厚的心肌病理變化及心臟功能。Fas還可以抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，提高機體抗氧化能力，發(fā)揮對心肌的保護作用。
　　 2.RhoA/Rho激酶通路參與了PE、AngⅡ所致大鼠心

15、肌細胞肥大；Rho激酶抑制劑Fas通過抑制該通路的激活，抑制c-fos蛋白的表達，改善PE、AngⅡ所致大鼠心肌細胞肥大，而與CaN通路、MAPK通路無關(guān)。Iso所致大鼠心肌細胞肥大不伴有RhoA/Rho激酶通路的激活。
　　 3.RhoA/Rho激酶信號通路參與了糖尿病心肌病的發(fā)病過程；Rho激酶抑制劑Fas可抑制該通路的激活，改善了糖尿病心肌病的心肌病理變化及心臟功能，延緩了向心力衰竭的發(fā)展；其機制可能與抑制AngⅡ/Gq/