實(shí)驗(yàn)兔糖尿病性心肌病心臟舒張功能不全CML和Titin的改變及坎地沙坦酯的作用.pdf

1、本研究分成三部分：第一部分，建立1型糖尿病兔模型，通過(guò)自身對(duì)照，使用心臟彩色多普勒檢測(cè)心臟功能變化，了解高糖血癥致心臟功能變化的特點(diǎn)，確定形成糖尿病性心肌病左室舒張功能不全的時(shí)間；第二部分，分組對(duì)照試驗(yàn)，探討糖尿病兔在心臟舒張功能不全時(shí)CML和心肌titin的變化，及其他常見(jiàn)室壁僵硬度相關(guān)因素改變；第三部分，藥物干預(yù)試驗(yàn)，在糖尿病兔成模后即予低劑量和高劑量的坎地沙坦酯口服，觀察藥物對(duì)糖尿病致心臟舒張功能不全的影響，并探討其作用環(huán)節(jié)。

2、r>　　 第一部分實(shí)驗(yàn)兔糖尿病性心肌病心功能變化特征
　　 一.目的
　　 了解四氧嘧啶致1型糖尿病兔模型心功能的發(fā)展規(guī)律，確定糖尿病性心肌病出現(xiàn)射血功能正常的心臟舒張功能不全的時(shí)間。
　　 二.方法
　　 建立四氧嘧啶致1型糖尿病兔模型。使用自身對(duì)照方法，按時(shí)間順序分別在成模前、成模后2周、4周、6周行心臟彩色多普勒檢查，確定各時(shí)間段心臟功能的變化特征。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　 三.結(jié)果

3、r>　　 心臟多普勒動(dòng)態(tài)觀察糖尿病兔心臟功能改變：與成模前自身對(duì)照，成模后2周各指標(biāo)無(wú)明顯改變(P＞0.05)；4周出現(xiàn)E/A比值倒置，EDT延長(zhǎng)(P＜0.05)，EF、LVFS無(wú)變化(P＞0.05)；6周出現(xiàn)EF、LVFS值下降(P＜0.05)。
　　 四.結(jié)論
　　 四氧嘧啶致1型糖尿病兔模型可出現(xiàn)心臟功能進(jìn)行性下降，早期表現(xiàn)為舒張功能不全，晚期出現(xiàn)收縮功能下降。成模后4周表現(xiàn)為EF正常的左室舒張功能不全。

4、　　 第二部分實(shí)驗(yàn)兔糖尿病性心肌病心臟舒張功能不全時(shí)室壁被動(dòng)僵硬度相關(guān)因素變化
　　 一.目的
　　 探討四氧嘧啶致1型糖尿病兔心臟舒張功能不全階段，心臟的結(jié)構(gòu)和功能變化特點(diǎn)。分別檢測(cè)室壁僵硬度相關(guān)因素：心肌細(xì)胞大小、心肌間質(zhì)纖維化程度、膠原可溶性、CML-AGEs沉積和心肌titin的變化，探討糖尿病性心肌病舒張功能不全的發(fā)生機(jī)制。
　　 二.方法
　　 1、實(shí)驗(yàn)分組：非對(duì)稱地隨機(jī)分為對(duì)照組(C組)1

5、0只，糖尿病組(D組)15只。
　　 2、成模后4周行心臟彩色多普勒檢查和左室導(dǎo)管并多巴酚丁胺負(fù)荷實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)心臟功能。
　　 3、采集血標(biāo)本測(cè)定一般生化指標(biāo)，放射免疫法測(cè)定血漿血管緊張素Ⅱ和醛固酮水平。
　　 4、采集心肌標(biāo)本分別行：
　　 (1)病理檢查：HE染色，測(cè)量心肌細(xì)胞橫切面積(cross-sectiona1 area,CSA)；Masson染色，計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume

6、 fraction,CVF)；透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)改變。
　　 (2)放射免疫法測(cè)定心肌組織血管緊張素Ⅱ水平。
　　 (3)酸水解法測(cè)羥脯氨酸，計(jì)算心肌可溶性膠原纖維比例。
　　 (4)免疫組化定量測(cè)定CML-AGEs沉積。
　　 (5)titin檢測(cè)：real time PCR法定量測(cè)定總titin、titin N2B和titin N2BA的mRNA表達(dá)；垂直電泳并染色測(cè)定總titin、titin N2

7、B和titin N2BA的蛋白表達(dá)。
　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　 三.結(jié)果
　　 1、左心功能評(píng)價(jià)：
　　 (1)心臟多普勒結(jié)果：糖尿病組與正常組相比E/A比值倒置，EDT延長(zhǎng)(P＜0.05)，EF、LVFS無(wú)變化(P＞0.05)。
　　 (2)血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果：糖尿病組與正常組相比LVEDP和T值升高，LV-dp/dtmax降低(P＜0.05)；LVSP、LV+dp/dtmax無(wú)明顯變化

8、(P＞0.05)。
　　 (3)多巴酚丁胺負(fù)荷實(shí)驗(yàn)：正常組在多巴酚丁胺刺激下隨劑量增多，LV±dp/dtmax均增強(qiáng)，尤以收縮功能增強(qiáng)為主；糖尿病組在中等劑量的多巴酚丁胺刺激下已開(kāi)始出現(xiàn)LV+dp/dtmax下降，LV-dp/dtmax無(wú)改善。
　　 2、左心形態(tài)學(xué)改變：
　　 (1)大體形態(tài)學(xué)改變：糖尿病組與正常組相比，心臟多普勒檢測(cè)左室各室壁厚度及室腔大小無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，左心室重量指數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差

9、異(P＞0.05)。
　　 (2)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變：與正常組相比，糖尿病組HE染色無(wú)心肌肥大表現(xiàn)，心肌細(xì)胞直徑無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；透射電鏡檢測(cè)可見(jiàn)糖尿病組少量肌絲呈局灶性溶解，部分線粒體腫脹、空泡化，肌纖維間脂滴堆積。
　　 3、心肌間質(zhì)膠原纖維改變：
　　 (1)膠原纖維含量測(cè)定：Masson染色顯示糖尿病組與正常組相比膠原含量稍增多，但CVF無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 (2)膠原纖維可溶性測(cè)定：糖尿病組與正常組相比

10、可溶性膠原纖維含量明顯下降(P＜0.05)。
　　 4、CML-AGEs免疫組化定量檢測(cè)：糖尿病組與正常組相比細(xì)胞間質(zhì)CML沉積數(shù)量明顯增多(P＜0.05)。CML平均光密度值(mean density,score/mm2)與血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)T呈線性相關(guān)關(guān)系(r=0.797，P＜0.05)。
　　 5、心肌titin的改變
　　 (1)蛋白定量檢測(cè)：糖尿病組與正常組相比，總titin量和N2B/N2BA無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

11、(P＞0.05)。
　　 (2) mRNA定量檢測(cè)：糖尿病組與正常組相比，總titin、titin N2B、titinN2BA的mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)(P＜0.05)。
　　 四.結(jié)論
　　 1、四氧嘧啶致1型糖尿病兔可呈糖尿病性心肌病病理改變，成模后4周表現(xiàn)為左室射血功能保留的舒張功能不全。
　　 2、CML-AGEs增多與糖尿病性心肌病早期心臟舒張功能不全相關(guān)。
　　 3、在糖尿病性心肌病早期

12、舒張功能不全階段，titin轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，但蛋白總量和亞型比例無(wú)明顯變化。
　　 第三部分坎地沙坦酯對(duì)糖尿病兔心臟舒張功能不全影響
　　 一.目的
　　 研究坎地沙坦酯對(duì)實(shí)驗(yàn)性兔糖尿病性心肌病舒張功能不全的影響及其作用環(huán)節(jié)。
　　 二.方法
　　 1、建立四氧嘧啶致1型糖尿病兔模型。
　　 2、隨機(jī)分組：糖尿病坎地沙坦低劑量組(簡(jiǎn)稱低劑量藥物組，DLA組)15只和糖尿病坎地沙坦高劑量組(簡(jiǎn)稱高

13、劑量藥物組，DHA組)15只。在成模后3天開(kāi)始給予坎地沙坦酯口服，口服劑量：DLA組1mg/kg/d，DHA組5mg/kg/d。
　　 3、成模后4周行心臟功能檢測(cè)，血標(biāo)本檢測(cè)和心肌標(biāo)本檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)和方法同第二部分。
　　 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，正常組、糖尿病組、DLA組和DHA組四組間采用單因素方差分析(analysis of variance,ANOVA)。若方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。

14、
　　 三.結(jié)果
　　 1、左心功能評(píng)價(jià)：
　　 (1)心臟多普勒結(jié)果：兩藥物組比較各指標(biāo)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。兩藥物組與糖尿病組相比均表現(xiàn)為E值升高，A值下降，E/A倒置逆轉(zhuǎn)，EDT延長(zhǎng)縮短(P＜0.05)。與正常組相比仍有E值下降，A值升高，E/A比值降低，EDT延長(zhǎng)(P＜0.05)。
　　 (2)血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果：DHA組血壓明顯下降(P＜0.05)，其余指標(biāo)兩藥物組間無(wú)明顯差異(P＞0.05)

15、。兩藥物組與糖尿病組相比LVEDP降低，LV-dp/dtmax和T值較前改善(P＜0.05)。與正常組相比上述指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 (3)多巴酚丁胺負(fù)荷實(shí)驗(yàn)：DLA組隨多巴酚丁胺劑量增多LV±dp/dtmax有增強(qiáng)；DHA組隨多巴酚丁胺劑量增多LV±dp/dtmax無(wú)變化。
　　 2、左心形態(tài)學(xué)改變：
　　 (1)大體形態(tài)學(xué)改變：四組間比較心臟多普勒檢測(cè)左室各室壁厚度及室腔大小無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P

16、＞0.05)，左心室重量指數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 (2)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變：四組間比較心肌細(xì)胞直徑無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；透射電鏡檢測(cè)DLA組和DHA組肌絲與線粒體改變與糖尿病組相似，但肌纖維間脂滴堆積較糖尿病組明顯減少。
　　 3、心肌間質(zhì)膠原纖維改變：
　　 (1)膠原纖維含量測(cè)定：正常組、糖尿病組、DLA組和DHA組的CVF(％)分別為：4.7±1.2，5.9±1.3，5.2±2.1，5.3±1.8(P＞

17、0.05)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 (2)膠原纖維可溶性測(cè)定：正常組、糖尿病組、DLA組和DHA組的的心肌組織可溶性膠原纖維含量(％)分別為：50.22±2.99，40.43±2.75，46.08±3.05，48.54±3.04(P＜0.05)。兩藥物組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩藥物組可溶性膠原纖維含量均較糖尿病組升高，具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4、糖基化終產(chǎn)物CML免疫組化定量檢測(cè)：正常組、糖尿病組、DLA組和DHA組的平均光密度值

18、(mean density,score/mm2)分別為：15.59±1.88，40.89±3.01，29.52±4.22，24.8±2.97(P＜0.05)。兩藥物組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩藥物組CML較糖尿病組明顯減少，具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5、心肌肌聯(lián)蛋白titin的改變
　　 (1)蛋白定量檢測(cè)：四組間比較總titin和N2B/N2BA亞型比值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)
　　 (2) mRNA定量檢測(cè)：兩藥物組