靶向啟動子的雙鏈小RNA改變核小體組織結(jié)構(gòu)激活基因表達.pdf

1、有關(guān)RNA干擾(RNA interference，RNAi)的研究已受到廣泛的關(guān)注并獲得了2006年的諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎。隨著科學(xué)家對RNA調(diào)控的深入研究，發(fā)現(xiàn)dsRNA(double-standed RNA，dsRNA)不僅可通過RNAi下調(diào)基因的表達，還可以通過靶向啟動子上調(diào)基岡轉(zhuǎn)錄水平，即RNA激活（RNA activation，RNAa）。這類RNA分子與發(fā)揮RNAi作用的干擾小RNA（small interfering RN

2、A，siRNA）相對應(yīng)，被稱為激活小RNA(small activating RNA，saRNA)。
　　saRNA與siRNA的調(diào)控方式仍有顯著不同，siRNA主要作用方式為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，通過降解mRNA影響蛋白質(zhì)的翻譯，從而下調(diào)基因的表達;而saRNA主要發(fā)揮轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，在啟動子區(qū)發(fā)揮作用，但目前saRNA的作用機制仍未闡明。因此，在人們將基因沉默或基因激活技術(shù)作為治療手段運用于不同疾病之前，有必要對其分子機制進行透徹的研究

3、。
　　saRNA主要通過在基因啟動子區(qū)的特異性結(jié)合來激活基因的轉(zhuǎn)錄，具有靶點依賴性的特征。我們發(fā)現(xiàn)，基于TATA box和CpG島(CpG island，CGI)對基因調(diào)控的影響，dsRNA激活具有四種啟動子類型。即:即Ⅱ型，有CGI和TATA box，轉(zhuǎn)錄起始位點(transcriptional start site，TsS)位于CGI上;Ⅱ型，有CGI，TSS位于CGI上，無TATA box;Ⅲ型為無CGI(或TSS不在CG

4、I上)，有TATA box;Ⅳ型，無CGI和TATA box。Ⅰ型，Ⅱ型和Ⅲ型啟動子中TATA box和CGI都可能對saRNA激活位點設(shè)計起重要作用，因此，研究TATA box和/或CGI位置對saRNA激活規(guī)律的影響，選擇Ⅰ型啟動子最為典型。研究TATA box和CGI以外的因素對saRNA激活規(guī)律的影響，則需選擇Ⅳ型啟動子。
　　通過以上saRNA的特點分析，本課題在研究saRNA激活機制的時候，選擇符合Ⅰ型啟動子的SOX2

5、基因，符合Ⅳ型啟動子的OCT4和NANOG基因進行研究。Oct4，Sox2和Nanog是重編程的三個核心因子，三個因子之間形成相互激活的自調(diào)控循環(huán)，因此應(yīng)用三因子可以相互激活的規(guī)律是驗證RNA激活的最佳策略之一。首先，我們按saRNA的靶點依賴性特征設(shè)計針對激活OCT4，SOX2和NANOG的dsRNA，通過RT-PCR、qRT-PCR和western-blot等檢測方法檢測dsRNA對基因的激活作用。結(jié)果證明:均篩選到針對OCT4、S

6、OX2和NANOG三個基因的激活dsRNA，并且檢測到Oct4、Sox2和Nanog三個因子在被saRNA激活后，又進一步發(fā)生三個因子之間的相互激活作用，確證了saRNA的激活效應(yīng)。通過對激活saRNA的分析，發(fā)現(xiàn)saRNA的激活存在四條規(guī)律:(1)兩個或三個saRNA可以同時激活各自靶基因;兩個saRNA能以協(xié)同增效的方式激活相同的靶基因;(2)Ⅰ型啟動子被saRNA激活后比Ⅳ型有更高的激活表達量;(3)靶位點越靠近TSS的saRNA

7、具有更高的激活效應(yīng);(4) saRNA靶位點通常位于RNA酶結(jié)合位點和TSS之間。
　　其次為進一步闡明saRNA的激活機制，我們通過CHIP及PCR方法對OCT4，SOX2和NANOG三個基因激活時組蛋白和RNA聚合酶Ⅱ與DNA結(jié)合情況進行定性分析，同時對H3組蛋白結(jié)合情況進行定量分析。發(fā)現(xiàn)有CGI和TATA box的Ⅰ型啟動子在saRNA激活后核小體組織結(jié)構(gòu)完全被改變;而Ⅳ型啟動子在saRNA激活后部分核小體組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

8、但都遵循相同的規(guī)律:在saRNA靶位點最近的位置導(dǎo)致核小體缺失。因此，我們認為saRNA激活基因的根本機制是由于核小體重定位導(dǎo)致啟動子上核小體組織結(jié)構(gòu)改變，進而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄激活。我們還進一步發(fā)現(xiàn)，核小體重定位只決定基因轉(zhuǎn)錄與否，并不影響基因的轉(zhuǎn)錄效率，基因的轉(zhuǎn)錄效率是由轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和saRNA靶點位置相互作用的結(jié)果。這些調(diào)控元件包括TATA box和CGI;對Ⅳ型啟動子來說，saRNA的靶位點在增強子和近端啟動子同樣有利于提高基因被激活轉(zhuǎn)錄

9、的效率。
　　通過上述研究，我們初步闡明了RNAa的機制:dsRNA結(jié)合在Ⅰ型啟動子TATA box下游的特異序列;或結(jié)合在Ⅳ型啟動子上轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合準備區(qū)如近端啟動子或增強子，dsRNA與靶點結(jié)合后募集染色質(zhì)重塑復(fù)合體、RNA酶Ⅱ及其它轉(zhuǎn)錄因子，進而引發(fā)核小體重塑。其結(jié)果是在saRNA靶位點附近產(chǎn)生核小體缺失區(qū)域(nucleosome depleted region,NDR)和saRNA靶位點上募集RNA聚合酶Ⅱ起始復(fù)合物(RNA

10、 polymeraseⅡinitiate complex,PIC)。NDR產(chǎn)生可消除阻攔PIC延伸道路上的核小體，使轉(zhuǎn)錄激活;如果saRNA靶點位于增強子區(qū)時，saRNA附近核小體缺失產(chǎn)生的NDR可使增強子區(qū)曝露，同時，saRNA募集蛋白起到反式激活因子的作用增強基因表達。
　　最后總結(jié)saRNA設(shè)計規(guī)律為:針對不同的基因，利用不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和saRNA靶點位置的相互作用進行saRNA設(shè)計能獲得更有效、更理想的RNA激活效應(yīng)。