miR-503靶向eIF4G增加乳腺癌細(xì)胞MCF-7-ADR的藥物敏感性.pdf

1、目的：研究miR-503靶向eIF4G對(duì)乳腺癌耐藥株MCF-7/ADR藥物敏感性的影響，eIF4G對(duì)多藥耐藥相關(guān)蛋白ABCB1，ABCC1，ABCG2的調(diào)控作用。
　　方法：生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)并篩選能與eIF4G基因3′UTR靶向結(jié)合的miRNA；Western blotting方法檢測(cè)細(xì)胞p-mTOR，p-4EBP1，ABCB1，ABCC1，ABCG2蛋白的表達(dá)；實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞ABCB1，ABCC1，ABCG2 m

2、RNA的水平；MTT法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)阿霉素，紫杉醇，他莫昔芬的藥物敏感性；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡；雙熒光素酶活性檢測(cè)法驗(yàn)證miRNA與eIF4G的靶向關(guān)系。
　　結(jié)果：生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示miR-503與eIF4G基因3'UTR區(qū)第340-346號(hào)堿基位能互補(bǔ)配對(duì)，同時(shí)在327-331存在四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。
　　Western blotting結(jié)果顯示，與阿霉素敏感株MCF-7相比，ATP結(jié)合盒蛋白基因（ABCB1，ABCC

3、1，ABCG2）在阿霉素耐藥株MCF-7/ADR中高表達(dá)。濃度大于等于50nM的雷帕霉素能降低MCF-7/ADR中p-mTOR，p-4EBP1，ABCB1，ABCC1，ABCG2蛋白的表達(dá)水平。miR-503能降低MCF-7/ADR細(xì)胞當(dāng)中eIF4G，ABCB1，ABCC1，ABCG2蛋白的表達(dá)。siR-eIF4G下調(diào)MCF-7/ADR細(xì)胞當(dāng)中eIF4G，ABCB1，ABCC1，ABCG2蛋白的表達(dá)。
　　實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)

4、結(jié)果顯示，在阿霉素耐藥株MCF-7/ADR中，ATP結(jié)合盒蛋白基因（ABCB1，ABCC1，ABCG2）相對(duì)表達(dá)量為1940.08±36.64，31.19±2.82，9.64±0.54均顯著性高于阿霉素敏感株MCF-7（ABCB1，ABCC1，ABCG2基因相對(duì)表達(dá)量分別為1±0.09，1±0.17，1±0.1），siR-eIF4G，miR-503 mimics，能降低MCF-7/ADR細(xì)胞當(dāng)中eIF4G mRNA的水平，但對(duì)MCF-7

5、/ADR細(xì)胞當(dāng)中ABCB1，ABCC1，ABCG2 mRNA的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素，他莫昔芬，紫杉醇的藥物敏感性較MCF-7細(xì)胞差，阿霉素處理組IC50分別為37.23±8.18μM、104.95±26.16μM；他莫昔芬處理組IC50分別為36.61±4.64μM、24.15±5.03μM；紫杉醇處理組IC50分別為3.23±0.76μM、11.52±6.58μM。聯(lián)用RAPA使

6、得MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素，紫杉醇，他莫昔芬的敏感性較單用藥物處理組增強(qiáng)，阿霉素處理組 IC50分別為79.65±28.66μM、119.34±36.06μM；他莫昔芬處理組IC50分別為18.41±9.19μM、25.02±2.36μM；紫杉醇處理組IC50分別為4.80±1.62μM、14.23±10.84μM。miR-503能增加MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素，紫杉醇，他莫昔芬的敏感性，阿霉素處理的未轉(zhuǎn)染組、NC組、miR-

7、503轉(zhuǎn)染組和miR-503 inhibitor轉(zhuǎn)染組的IC50分別為52.00±23.05μM、52.99±22.08μM、29.88±4.65μM、52.05±19.16μM；他莫昔芬處理的未轉(zhuǎn)染組、NC組、miR-503轉(zhuǎn)染組和miR-503 inhibitor轉(zhuǎn)染組的IC50分別為29.58±4.90μM、30.42±7.42μM、18.68±2.78μM、35.94±10.03μM；紫杉醇處理的未轉(zhuǎn)染組、NC組、miR-503

8、轉(zhuǎn)染組和miR-503 inhibitor轉(zhuǎn)染組的IC50分別為5.99±3.00μM、3.83±1.32μM、2.53±0.77μM、6.84±3.31μM。用siRNA敲低eIF4G，MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素，紫杉醇，他莫昔芬的敏感性增加，阿霉素處理的未轉(zhuǎn)染組、NC組、siR-eIF4G組的IC50分別為51.62±20.05μM、86.04±57.47μM、37.61±18.82μM；他莫昔芬理的未轉(zhuǎn)染組、NC組、siR-e

9、IF4G組的IC50分別為15.98±2.61μM、22.20±6.04μM、16.23±2.48μM；紫杉醇處理的未轉(zhuǎn)染組、NC組、siR-eIF4G組的IC50分別為16.73±6.56μM、5.76±1.48μM、3.77±0.82μM。
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，eIF4G siRNA，miR-503 mimics使細(xì)胞G1期延長(zhǎng)，細(xì)胞的凋亡比例增加。
　　雙熒光素酶活性檢測(cè)，結(jié)果顯示miR-503能通過(guò)結(jié)合eIF

10、4G基因3'UTR影響其熒光活性改變。在轉(zhuǎn)染克隆有eIF4G基因3'UTR質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)中miR-503組與空白組以及NC組相比較，綠色熒光蛋白表達(dá)明顯降低。
　　結(jié)論：
　　1、miR-503能夠靶向eIF4G基因，下調(diào)其mRNA和蛋白的表達(dá)水平；
　　2、eIF4G能調(diào)控ABCB1，ABCC1和ABCG2蛋白的表達(dá)，從而影響乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素，他莫昔芬，紫杉醇的藥物敏感性；
　　3、miR-50